Пузыреплодник золотистый: Страница не найдена — АгроГном

сорта и особенности — sdelayzabor.ru

Листопадные кустарники выполняют важную роль в ландшафтном дизайне. Они являются связующим звеном между травянистыми газонами и древесными формами. С этой ролью отлично справляется пузыреплодник желтолистный, который отлично смотрится как в живой изгороди, так и в одиночных посадках или декоративных композициях. Этот кустарник имеет множество сортов с изумрудными, пурпурными и желтыми листьями. Яркая окраска желтолистных разновидностей может стать настоящим украшением сада.

Пузыреплодник желтолистный дартс голд

Преимущества желтолистных сортов пузыреплодника

Кустарники с листьями желтого окраса весной и летом смотрятся особенно декоративно, выделяясь ярким пятном на фоне сочной зелени. Осенний наряд этих сортов гармонично вписывается в общую картину уходящего лета. Но не только за эти качества стоит купить и посадить пузыреплодник с золотистыми листьями:

• Кустарники с золотисто-желтой листвой декоративны в течение всего теплого сезона
• Все сорта неприхотливы в уходе и нетребовательны к условиям произрастания
• Садоводы отмечают их особую устойчивость к болезням и климатическим условиям
• Стрижка кустарников способствует разрастанию и большей декоративности
• Посадочный материал доступен для покупателей с разными финансовыми возможностями

Стоит отметить, что растения с солнечной желтизной немного хуже переносят сильные морозы. Слабые и молодые ветви могут обмерзать в особенно лютые зимы. Но кустарники быстро восстанавливаются после весенней стрижки и становятся еще более пышными и нарядными.

Пузыреплодник желтолистный — описание сортов

Селекционеры, которые специализируются на выведении новых сортов пузыреплодника калинолистного, стремятся получить красивые кустарники с цветными листьями. От видовых растений они должны отличаться также меньшими размерами.

Ярким золотом радуют весь теплый сезон следующие сорта пузыреплодника:

«Luteus» (Лютеус)

Листья этого пузыреплодника по своему внешнему виду напоминают виноградные. Пышное растение с возрастом достигает высоты 2,5 – 3 метров. Высоту и диаметр кустарника можно регулировать с помощью стрижки, добиваясь и его необыкновенной густоты. При распускании листочки демонстрируют красивый желтый оттенок, который жарким летом приобретает салатовые нотки. Листья имеют красивую форму эллипса, а края украшены резным кантом. Этот сорт отличает непереносимость излишней влаги в почве, поэтому его не стоит высаживать в низинных заболоченных местах.

Пузыреплодник желтолистный лютеус

«Dart`s Gold» (Дартс Голд)

Пузыреплодник дартс голд

Практически весь сезон кустарники красуются ярко-желтой листвой, которая с наступлением осени превращается в настоящее пылающее чудо.

Растения этого сорта пузыреплодника не вырастают более 2 метров. Поэтому их удобно высаживать в виде живой изгороди.

«Nugget» (Наггет)

Пузыреплодник желтолистный Наггет — в разные периоды

Кустарники высотой 1,5 – 2 метра красуются желтыми листьями в начале сезона. Со временем они приобретают зеленоватый оттенок. Листочки этого сорта пузыреплодника гораздо меньше, чем у других разновидностей. Взрослые кустарники приобретают форму вазы. Все это благодаря толстым, вертикально растущим ветвям.

Все эти сорта отличает белесый оттенок соцветий и плодов.

Условия произрастания

Кустарники пузыреплодника, имеющие желтые листья, прекрасно будут чувствовать себя в любой части двора или сада. Они одинаково хорошо развиваются на открытой местности, в тени и полутени. Однако, для того, чтобы листва сохраняла интенсивность цвета в течение всего сезона, ей требуется достаточно света. При недостатке солнечных лучей она бледнеет и приобретает обыденный зеленый оттенок.

Желтолистные кустарники пузыреплодника не боятся ветров и неплохо переносят сильные морозы (до — 34ᵒ).  При частичном обмерзании они быстро восстанавливаются. Молодые кустики в первый год посадки рекомендуется укрывать на период холодов.

Пузыреплодник с золотистым оттенком листьев не предъявляет особенных требований к составу грунта. Но хуже будет расти на известковых почвах. Также следует избегать застоя влаги в местах посадки ярких кустарников.

Секреты посадки и ухода

Посадка и уход за желтолистными сортами пузыреплодника не сильно отличается от пурпурных и изумрудных разновидностей. Правила достаточно просты:

• Покупать посадочный материал лучше всего тот, который выращен контейнерным способом. Растения с закрытой корневой системой можно высаживать весь теплый сезон.
• Посадочные ямы должны быть немного больше размера корневой системы. Обычно их делают глубиной и диаметром не меньше 50 сантиметров. На дно каждой ямы высыпают слой питательного грунта, в составе которого обязательно должен быть торф.
• Молодые саженцы пузыреплодника вместе с земляным комом помещают в посадочные ямы и засыпают слоем плодородной земли. Побеги можно заглубить на 3 – 5 сантиметров, чтобы дать толчок к развитию спящих почек, из которых вырастут новые побеги.
• Обильный полив молодых саженцев – обязательное условие при посадке. Чтобы растения безболезненно укоренились, их можно полить раствором «Корневина».
• Приствольные круги можно замульчировать обычной землей. Эта процедура будет способствовать сохранению влаги, а также препятствовать образованию земляной корки. Корни при этом будут получать достаточное количество кислорода.
• Частота полива зависит от условий произрастания кустарников. В жаркий период их можно поливать пару раз в неделю, выливая под каждый куст до 30 литров воды. С осторожностью к этой процедуре нужно подходить там, где преобладают суглинистые почвы, где есть опасность застоя влаги.
• Обрезку пузыреплодника можно делать сразу же после посадки. Она будет способствовать лучшему ветвлению кустарников. Санитарная стрижка проводится по мере надобности. А вот формирующая обрезка – ранней весной, еще до распускания почек, или поздней осенью, когда вегетативный сезон заканчивается.

Возможные болезни и вредители

Все сорта пузыреплодника, в том числе и желтолистные, редко повреждаются болезнями и практически не подвержены атакам вредителей. Но если вы заметили какие-то изменения, то следует знать некоторые секреты реанимации любимых растений:

• Если после пересадки начали сохнуть листья, это признак того, что саженцы плохо адаптировались на новом месте. Полив стимуляторами роста поможет справиться им с трудностями укоренения.
• Если начинают сохнуть краешки листочков, причиной может быть слишком жаркий климат. Под яркими лучами солнца краешки листьев обгорают.
• А вот темные края листьев – верный признак мучнистой росы, которая поражает растение при застое влаги в почве.
• Если пузыреплодник не цветет, то следует внимательно ознакомиться с правилами обрезки. Соцветия у этого растения образуются только на молодых сформировавшихся побегах.

Использование в ландшафтном дизайне

Пузыреплодник с окраской листвы желтого цвета можно успешно использовать для посадки живой изгороди. Конечно, для таких больших кустарников, места должно быть достаточно.

Желтые кустарники пузыреплодника могут служить прекрасным фоном для других ярких растений, например, барбариса или лапчатки кустарниковой, а также для травянистых многолетников.

А вот на фоне хвойных композиций желтый пузыреплодник может выступать в качестве солитера. В одиночном порядке кустарник высаживают на газонах. В любом из вариантов он разнообразит внешний вид сада, клумбы или газона.

описание сортов с фото, посадка и уход

Среди большого разнообразия декоративных растений особое место занимает желтый пузыреплодник, ценимый садоводами за неприхотливость и красивый внешний вид. Это растение имеет шаровидную густую крону из раскидистых ветвей с крупными листьями, образующими «пышную накидку». Культура относится к многолетним листопадным кустарникам. В описании сорта указано, что желтый пузыреплодник неприхотлив и не требует особых условий для посадки и ухода. Кустарник отлично растет в умеренных и северных широтах на солнечных участках.

Сорта пузыреплодника с желтыми листьями

Существует множество декоративных сортов желтого пузыреплодника, которые отличаются по форме и окраске листьев, по размеру.

Дартс Голд

Желтый пузыреплодник Дартс Голд (на фото) выведен в Голландии и является гибридом сортов Нанус и Люеус. Кустарник вырастает до 1,5 метров в высоту и покрыт густо и равномерно нежно-желтой листвой. При распускании листья оранжево – желтого цвета, летом – зеленые, а осенью приобретают желтовато-красный оттенок. В июне культура покрывается кремовыми цветами. Пузыреплодник этого сорта не требователен к почвам и отлично переносит обрезку, поэтому активно используется для живых изгородей как одиночно, так и в смешанных многолетних композициях.

Лютеус (Ауреус)

Желтый пузыреплодник Лютеус (Ауреус) (на фото)– быстрорастущий саженец, достигающий 3-3,5 м в высоту и до 4 м в ширину. При распускании листья имеют оранжево- желтую листву, которая зеленеет к лету, а осенью приобретают бронзовый окрас. Сорт не требователен к почве и солнцу, устойчив к болезням и вредителям, морозоустойчив. Используется для создания композиций, в одиночных посадках и в живых изгородях.

Голд Спирит

Голд Спирит – кустарник, достигающий высоты 2 м. Листья на протяжении всего сезона золотисто–желтого цвета. Отлично переносит стрижку.

Фото пузыреплодника калинолистного золотистого Голд Спирит представлено ниже.

Эмбер Джубили

Эмбер Джубили необычайно яркий, красочный и компактный куст, достигающий 2 м в высоту и 1,5 м в ширину. Листья на краях ветвей красно – оранжевые, а ближе к кроне приобретают желтовато-зеленый оттенок со множеством переходов. Особенно красиво выглядит при посадке на солнце. Если культура растет в тени, листва теряет интенсивность окраски. Сорт морозоустойчив. Используется в живых изгородях, как в одиночку, так и в сочетании с другими многолетними кустарниками.

Энджел Голд

Энджел Голд – раскидистый куст высотой до 2 метров. Листья такой же формы, как и у сорта Диабло. При распускании листья желтые, впоследствии немного зеленеющие, а к осени снова приобретающие желтый окрас. Цветки у кустарника белого цвета.

Наггет

Сорт Наггет был выведен в США. Кустарник вырастает до 2,5 м в высоту. Листья в начале распускания яркого желтого цвета, к середине лета немного зеленеют, а к осени опять желтеют. Цветки у кустарника кремово- белые с розоватыми тычинками.

Голден Наггет

Сорт отличается интенсивно меняющейся окраской листьев на протяжении всего сезона. Вырастает до 2 м в высоту и до 2 м в диаметре. Весной листья окрашены в золотисто- желтый цвет, летом зеленеют, а осенью снова желтеют. Цветки у кустарника розовато-белые с легким, приятным ароматом. Отлично растет как на солнце, так и в затененных местах (только окрас листьев меняется на зеленый).

Пузыреплодник золотистый в ландшафтном дизайне

Желтый пузыреплодник калинолистный в России используют как декоративное растение с середины XIX века и широко применяют для ландшафтного оформления: живых изгородей, для деления участка на зоны, а также оформления бордюров. Отлично смотрится как в одиночных, так и в групповых посадках.

Благодаря тому, что желтый пузыреплодник хорошо переносит загазованность, его часто можно встретить в городских скверах и парках. Даже поблизости от дороги кустарник будет отлично разрастаться и создаст защиту от выхлопных газов и пыли.

Благодаря тому, что кустарник прекрасно переносит обрезку, существует возможность придания любой формы (цилиндр, шар, линия).

Желтый пузыреплодник можно выращивать как на солнце, так и в полутени или тени. Чтобы сорта кустарников с золотистыми, желтыми и пурпурными листьями выглядели ярко и красиво, их рекомендуют высаживать на освещенные солнцем места.

При формировании живых изгородей хорошо сочетаются сорта с красными (лиловыми) и с золотистыми (желтыми) листьями. А пурпурные сорта станут отличным фоном для светлых многолетних кустарников.

Оригинально выглядит желтый пузыреплодник по соседству с хвойными кустарниками, такими как туя и можжевельник.

Например, зеленовато- желтый Дартс Голд отлично будет смотреться в сочетании с бордово-бронзовым Рэд Барон или золотистый Наггет с пурпурным сортом Диабл Дор. Эти композиции можно посадить, чередуя цвета или параллельно друг другу.

Для ограждения детской площадки или отделения огорода от придомовой территории отлично подойдут такие сорта невысокого желтого пузыреплодника, как Эмбер Джубили или Дартс Голд.

Посадка и уход за желтым пузыреплодником

Желтый пузыреплодник достаточно неприхотлив, но существуют некоторые нюансы посадки и ухода за ним. Длительность вегетативного периода у этого кустарника достигает 40 лет. При должном уходе саженец за один год вырастает на 40 см в длину и ширину.

Подготовка посадочного участка

Как и большинство растений, желтый пузыреплодник любит места хорошо освещенные, вдали от больших деревьев. Если его посадить в полузатененном или затененном месте, то окрас листьев приобретает зеленый оттенок.

Пузыреплодник хорошо разрастается на плодородных, дренированных суглинистых почвах со слабокислой или нейтральной кислотностью.

Его можно высаживать поблизости дорог, т. к. кустарник выдерживает загазованность воздуха и это одно из преимуществ.

Высаживают кустарник в начале осени или ранней весной. Если у саженцев закрытая корневая система, посадку можно производить в любое время года (кроме зимы).

Для высаживания желтого пузыреплодника есть всего два условия к почве – это наличие хорошего дренажа и отсутствие в нем извести.

Чтобы земля успела осесть, нужно за две недели до посадки подготовить яму шириной 0,5 м и добавить в нее смесь садового грунта: дерновая земля, песок и торф, в пропорции 2:1:1. Вместо торфа можно применять перегной.

Правила посадки

Для посадки желтого пузыреплодника рекомендуется приобретать крепкие саженцы кустарника с корневой системой закрытого типа в специализированных организациях.

Совет! Оригинальный окрас листьев не передается при посадке семенами, поэтому использовать такой способ размножения не рекомендуется.

Саженец аккуратно извлекают из контейнера, чтобы не повредить ком с корнями, ставят в заранее подготовленную яму, заглубляя саженец на 5 см (это даст возможность выпустить дополнительные побеги).

Яму заполняют плодородной землей, после чего поливают раствором Корневина. Когда раствор уйдет с поверхности земли – место вокруг саженца мульчируют для того, чтобы не образовалась поверхностная корка и корни получили необходимое количество воздуха.

Для живой изгороди нужно высаживать кустарники в шахматном порядке в два ряда. Расстояние между рядами нужно выдерживать 35см, а в ряду 45 см.

Полив и подкормка

Частота поливов желтого пузыреплодника зависит от многих факторов: возраста кустарника, типа грунта, климатических условий.

В жарком климате кустарник хорошо приживается на легких суглинистых почвах. Полив необходим регулярный с конца весны и до начала осени. Взрослый кустарник поливают два раза в неделю, используя 40 л воды. Полив кустарника осуществляют непосредственно под растение утром или вечером (после захода солнца).

Важно! Поливать нужно под основание куста, избегая попадания на листья и соцветия.

Если желтый пузыреплодник не замульчирован, то нужно взрыхлить почву после полива.

При выращивании кустарника на газонах или на глинистой почве есть опасность переувлажнения и заражения мучнистой росой.

Ранней весной и поздней осенью нужно производить подкормку пузыреплодника. Если кустарник растет на плодородной почве, то дополнительно вносить удобрения не нужно. Через 2–3 года после посадки культуру подкармливают два раз в год. Ранней весной удобряют раствором коровяка. На10 л воды потребуется 0,5 л коровяка, 15 г карбамида (мочевины) или 20 г аммиачной селитры (расчет на один куст). Под желтый пузыреплодник десятилетнего возраста понадобится 15 л питательного раствора.

Осенью подкармливают раствором нитроаммофоски из расчета 30 г на 10 л воды. Под каждый куст вносят 10-15 л раствора.

Обрезка

Желтый пузыреплодник обрезают в санитарных целях и для формирования красивого куста.Санитарную обрезку проводят весной: удаляют засохшие, подмерзшие и растущие внутрь ветки.

Формирующую обрезку можно проводить весной, после цветения или осенью, после остановки вегетации.

Существует два варианта обрезки:

• чтобы получился мощный и широкий кустарник с большим количеством стволов, обрезку проводят на высоте 0,5 м от почвы и убирают половину от всей длины прироста;
• при втором варианте обрезают все тонкие побеги у основания куста, оставляя до 5 штук самых мощных.

Стрижку живой изгороди необходимо проводить несколько раз за период вегетации. Первую процедуру проводят ранней весной до начала фазы активного распускания почек.

Один раз в пять лет растению требуется омолаживающая обрезка, которая заключается в избавлении от всех старых побегов до самого основания. После такой процедуры все толстые побеги обрабатывают садовым варом.

Подготовка к зиме

Желтый пузыреплодник обладает отличной устойчивостью к морозам, поэтому взрослый кустарник может зимовать без укрытия. Молодые саженцы, которые осенью прошли обрезку и подкормку, укрывают лапником.

Если ожидается морозная зима, то пузыреплодник аккуратно стягивают шпагатом и утепляют колпаком из рубероида.

Размножение

Желтый пузыреплодник размножается несколькими способами: семенами, делением куста, отводками и черенкованием.

Размножение делением куста

Опытные садоводы утверждают, что деление куста является самым легким способом. Процедуру проводят весной или осенью. Для этого выкапывают взрослый кустарник и делят на части таким образом, чтобы в каждой из них присутствовала корневая система и несколько побегов. Чтобы корневая система не успела высохнуть, рекомендуется сразу же высаживать полученные кустики в заранее подготовленные ямы.

Размножение семенами

При семенном размножении кустарник будет иметь классические характеристики, не повторяя декоративные особенности материнского растения.

На протяжении месяца семена выдерживают при определенной температуре (стратифицируют). Затем высаживают в открытый грунт. Когда всходы немного подрастут, их пересаживают на постоянное место.

Размножение отводками

Размножение желтого пузыреплодника отводками показало хорошие результаты и широко применяется садоводами.

Эту процедуру проводят вначале весны, чтобы до наступления зимы отводок укоренился. Для отводка выбирают здоровый, сильный побег, который растет наружу. Удаляют все листья, кроме тех, которые расположены на верхушке. Побег укладывают в ямку глубиной 15 см и пришпиливают при помощи деревянной скобы к земле.

В конце осени молодой отводок отделяют от материнского растения и подготавливают к зиме как описано выше.

Можно воспользоваться другим способом. Для этого пригибают нижнюю ветку к земле, фиксируют при помощи рогатки и подпирают верхушку. Окончательно пересадку проводят только следующей весной.

Размножение черенкованием

При размножении желтого пузыреплодника черенкованием используют молодые зеленые побеги, которые выросли в текущем году. Весной до начала цветения выбирают побеги 10-20 см в длину с 3-4 почками и срезают под углом 45°, нижние листья удаляют. Отделенные побеги замачивают на сутки в растворе Корневина или Гетероауксина, который способствует корнеобразованию. Затем высаживают в субстрат песка с торфом или просто в речной песок. Поливают черенки и укрывают полиэтиленом. Если черенков мало, можно использовать для укрытия пластиковые бутылки без горловины.

Дальнейший уход состоит в своевременном увлажнении почвы и систематическом проветривании. Перед началом зимы укрывают укорененные черенки. Весной черенки можно высаживать на постоянное место.

Болезни и вредители

Желтый пузыреплодник отличается устойчивостью к болезням и вредителям. Т. к. кустарник не любит переувлажнения, при избыточном внесении воды возможно развитие мучнистой росы, что приводит к гибели саженца.

Из-за нехватки питательных веществ (железа, магния) может развиться хлороз, который характеризуется несвойственным сорту пожелтением и усыханием молодых побегов. Чтобы избавиться от проблемы, достаточно опрыскать растение препаратами железа и марганца (Антихлороз, Хелат, Феррилен, Феровит) под корень.

Заключение

Желтый пузыреплодник – неприхотливый кустарник, который станет украшением сада с весны и до поздней осени. Он будет элементом ландшафтного дизайна, позволяющего придать участку ухоженный вид.

посадка и уход, виды и сорта, фото.

Пузыреплодник содержит около 14 видов, распространенных в Восточной Азии, а также Северной Америке.

Листопадный, декоративный кустарник, малотребователен к почве, очень плохо переносит избыточное увлажнение и застой влаги. Пузыреплодник теневынослив, засухо- и газоустойчив.

Размножается черенками, семенами, делением куста. Пузыреплодник используется в групповых и одиночных посадках, вдоль дорог, для живых изгородей.

Популярные виды и сорта

Пузыреплодник амурский

Произрастает в подлеске смешанных лесов Северного Китая, Кореи и Дальнего Востока. Растет пузыреплодник амурский одиночно или малыми группами на каменистых склонах, в зарослях кустарников. Пузыреплодник амурский охраняется в заповедниках.

Пузыреплодник амурский — кустарник высотой около 3 м, с шаровидной, широкой кроной. Кора старых стволиков пузыреплодника амурского шелушится продольными полосками. Молодые побеги каштановые, гладкие. Листья 3-5-лопастные, с сердцевидным основанием, до 10 см длиной, сверху зеленые, снизу от звездчатых волосков серовато-войлочные.

Цветки белые, около 1,5 см диаметром, собраны в щитковидные соцветия, по 15, цветут около 20 дней, чашелистики и цветоножки войлочно-опушенные. Плоды по мере созревания краснеющие, придают кустарнику декоративный вид. 

Пузыреплодник амурский — зимостойкий, побеги одревесневают полностью. В культуре он с 1854 года. Известный сорт Лутеус (‘Luteus’) летом с ярко-желтыми листьями и в осенней окраске бронзовыми, а также Ауреомаргината (‘Aureomarginata’) — с золото темной каймой на листьях и Нана (‘Nana’) — карликовый сорт с темными зелеными листьями.

Пузыреплодник калинолистный

В естественных условиях растет в Северной Америки, в зарослях кустарников и в подлеске по берегам рек.

Пузыреплодник калинолистный — кустарник около 3 м в высоту с раскидистыми, поникающими ветвями, образующими полушаровидную, густую крону. Листья пузыреплодника калинолистного 3-5-лопастные, округло-эллиптические, около 4 см, с более крупной, вытянутой долей, сверху зеленые, снизу светлые, пильчато-зубчатые по краю, порой слегка опушенные. Цветки 1,2 см, розовые или белые, с красными тычинками.

Плоды — очень эффектны, сборные, по мере созревания меняют окраску от зеленой до красноватой. В культуре пузыреплодник калинолистный с 1864 года. 

Имеет декоративные формы, отличающиеся окраской листьев: с темно-зелеными, с золотисто-желтыми, с золотисто-желтыми по краю. 

Пузыреплодник калинолистный Дартс Голд (‘Dart’s Gold’). Широкий и плотный кустарник 1,5 м в высоту. Листва пузыреплодника калинолистного Дартс Голд весь сезон сохраняют ярко-желтый цвет, незначительно зеленея летом.

Весной на кустарнике появляются кисти белых или розоватых цветков.

Пузыреплодник калинолистный Диабло (‘Diabolo’). Раскидистый кустарник в высоту около 3 м с темными, пурпурными листьями. Если пузыреплодник Диабло посажен в тени, то листья делаются зелеными с пурпурным оттенком.

Осенью окраска листьев не меняется. Сажают пузыреплодник Диабло в контрастных группах с другими декоративными кустарниками и многолетниками.

Пузыреплодник калинолистный Лютеус (‘Luteus’). Кустарник в высоту около 3 м (растет быстро), при распускании листья желтого цвета с прекрасным оранжевым оттенком, в летний период они зеленеют, и только осенью к листьям возвращается золотистая окраска. Цветет пузыреплодник калинолистный Лютеус белыми цветками, которые в сентябре превращаются в плоды.

Минусом этого сорта является непостоянство золотистого цвета листьев, который проявляется только на самых молодых приростах. Молодые побеги пузыреплодника калинолистного Лютеус светло-желтого цвета. 

Пузыреплодник калинолистный Ред Барон (‘Red Baron’). Кустарник высотой 2 м. Листья овальные, и 3-5 – лопастные, до 7 см длиной, по краю пильчато-зубчатые, голые, с роскошной темно – красной окраской. Цветки пузыреплодника Ред Барон белые с розовым оттенком, собраны они в зонтичные соцветия в диаметре до 5 см.

Плоды красные. Пузыреплодник калинолистный Ред Барон дает интересный колоритный акцент на приусадебных участках. Является очень ценным сортом.

Пузыреплодник может расти и в тени, но пурпурные и золотистые листья нуждаются в солнечном свете, поэтому лучше всего солнечное место.

Морозостоек, однако, молодые побеги в суровые зимы могут подмерзать. Не переносит застой влаги. При семенном размножении золотистые формы пузыреплодника могут передавать оригинальный цвет листьев части потомства.

описание сортов с фото, посадка и уход

Автор admin На чтение 38 мин. Опубликовано 24.01.2020

Пузыреплодник желтолистный: сорта и особенности

Листопадные кустарники выполняют важную роль в ландшафтном дизайне. Они являются связующим звеном между травянистыми газонами и древесными формами. С этой ролью отлично справляется пузыреплодник желтолистный, который отлично смотрится как в живой изгороди, так и в одиночных посадках или декоративных композициях. Этот кустарник имеет множество сортов с изумрудными, пурпурными и желтыми листьями. Яркая окраска желтолистных разновидностей может стать настоящим украшением сада.

Пузыреплодник желтолистный дартс голд

Преимущества желтолистных сортов пузыреплодника

Кустарники с листьями желтого окраса весной и летом смотрятся особенно декоративно, выделяясь ярким пятном на фоне сочной зелени. Осенний наряд этих сортов гармонично вписывается в общую картину уходящего лета. Но не только за эти качества стоит купить и посадить пузыреплодник с золотистыми листьями:

• Кустарники с золотисто-желтой листвой декоративны в течение всего теплого сезона
• Все сорта неприхотливы в уходе и нетребовательны к условиям произрастания
• Садоводы отмечают их особую устойчивость к болезням и климатическим условиям
• Стрижка кустарников способствует разрастанию и большей декоративности
• Посадочный материал доступен для покупателей с разными финансовыми возможностями

Стоит отметить, что растения с солнечной желтизной немного хуже переносят сильные морозы. Слабые и молодые ветви могут обмерзать в особенно лютые зимы. Но кустарники быстро восстанавливаются после весенней стрижки и становятся еще более пышными и нарядными.

Пузыреплодник желтолистный — описание сортов

Селекционеры, которые специализируются на выведении новых сортов пузыреплодника калинолистного, стремятся получить красивые кустарники с цветными листьями. От видовых растений они должны отличаться также меньшими размерами.

Ярким золотом радуют весь теплый сезон следующие сорта пузыреплодника:

«Luteus» (Лютеус)

Листья этого пузыреплодника по своему внешнему виду напоминают виноградные. Пышное растение с возрастом достигает высоты 2,5 – 3 метров. Высоту и диаметр кустарника можно регулировать с помощью стрижки, добиваясь и его необыкновенной густоты. При распускании листочки демонстрируют красивый желтый оттенок, который жарким летом приобретает салатовые нотки. Листья имеют красивую форму эллипса, а края украшены резным кантом. Этот сорт отличает непереносимость излишней влаги в почве, поэтому его не стоит высаживать в низинных заболоченных местах.

Пузыреплодник желтолистный лютеус

«Dart`s Gold» (Дартс Голд)

Практически весь сезон кустарники красуются ярко-желтой листвой, которая с наступлением осени превращается в настоящее пылающее чудо.

Растения этого сорта пузыреплодника не вырастают более 2 метров. Поэтому их удобно высаживать в виде живой изгороди.

«Nugget» (Наггет)

Кустарники высотой 1,5 – 2 метра красуются желтыми листьями в начале сезона. Со временем они приобретают зеленоватый оттенок. Листочки этого сорта пузыреплодника гораздо меньше, чем у других разновидностей. Взрослые кустарники приобретают форму вазы. Все это благодаря толстым, вертикально растущим ветвям.

Все эти сорта отличает белесый оттенок соцветий и плодов.

Условия произрастания

Кустарники пузыреплодника, имеющие желтые листья, прекрасно будут чувствовать себя в любой части двора или сада. Они одинаково хорошо развиваются на открытой местности, в тени и полутени. Однако, для того, чтобы листва сохраняла интенсивность цвета в течение всего сезона, ей требуется достаточно света. При недостатке солнечных лучей она бледнеет и приобретает обыденный зеленый оттенок.

Желтолистные кустарники пузыреплодника не боятся ветров и неплохо переносят сильные морозы (до — 34ᵒ). При частичном обмерзании они быстро восстанавливаются. Молодые кустики в первый год посадки рекомендуется укрывать на период холодов.

Пузыреплодник с золотистым оттенком листьев не предъявляет особенных требований к составу грунта. Но хуже будет расти на известковых почвах. Также следует избегать застоя влаги в местах посадки ярких кустарников.

Секреты посадки и ухода

Посадка и уход за желтолистными сортами пузыреплодника не сильно отличается от пурпурных и изумрудных разновидностей. Правила достаточно просты:

• Покупать посадочный материал лучше всего тот, который выращен контейнерным способом. Растения с закрытой корневой системой можно высаживать весь теплый сезон.
• Посадочные ямы должны быть немного больше размера корневой системы. Обычно их делают глубиной и диаметром не меньше 50 сантиметров. На дно каждой ямы высыпают слой питательного грунта, в составе которого обязательно должен быть торф.
• Молодые саженцы пузыреплодника вместе с земляным комом помещают в посадочные ямы и засыпают слоем плодородной земли. Побеги можно заглубить на 3 – 5 сантиметров, чтобы дать толчок к развитию спящих почек, из которых вырастут новые побеги.
• Обильный полив молодых саженцев – обязательное условие при посадке. Чтобы растения безболезненно укоренились, их можно полить раствором «Корневина».
• Приствольные круги можно замульчировать обычной землей. Эта процедура будет способствовать сохранению влаги, а также препятствовать образованию земляной корки. Корни при этом будут получать достаточное количество кислорода.
• Частота полива зависит от условий произрастания кустарников. В жаркий период их можно поливать пару раз в неделю, выливая под каждый куст до 30 литров воды. С осторожностью к этой процедуре нужно подходить там, где преобладают суглинистые почвы, где есть опасность застоя влаги.
• Обрезку пузыреплодника можно делать сразу же после посадки. Она будет способствовать лучшему ветвлению кустарников. Санитарная стрижка проводится по мере надобности. А вот формирующая обрезка – ранней весной, еще до распускания почек, или поздней осенью, когда вегетативный сезон заканчивается.

Возможные болезни и вредители

Все сорта пузыреплодника, в том числе и желтолистные, редко повреждаются болезнями и практически не подвержены атакам вредителей. Но если вы заметили какие-то изменения, то следует знать некоторые секреты реанимации любимых растений:

• Если после пересадки начали сохнуть листья, это признак того, что саженцы плохо адаптировались на новом месте. Полив стимуляторами роста поможет справиться им с трудностями укоренения.
• Если начинают сохнуть краешки листочков, причиной может быть слишком жаркий климат. Под яркими лучами солнца краешки листьев обгорают.
• А вот темные края листьев – верный признак мучнистой росы, которая поражает растение при застое влаги в почве.
• Если пузыреплодник не цветет, то следует внимательно ознакомиться с правилами обрезки. Соцветия у этого растения образуются только на молодых сформировавшихся побегах.

Использование в ландшафтном дизайне

Пузыреплодник с окраской листвы желтого цвета можно успешно использовать для посадки живой изгороди. Конечно, для таких больших кустарников, места должно быть достаточно.

Желтые кустарники пузыреплодника могут служить прекрасным фоном для других ярких растений, например, барбариса или лапчатки кустарниковой, а также для травянистых многолетников.

А вот на фоне хвойных композиций желтый пузыреплодник может выступать в качестве солитера. В одиночном порядке кустарник высаживают на газонах. В любом из вариантов он разнообразит внешний вид сада, клумбы или газона.

Пузыреплодник калинолистный: посадка и уход, сорта

Автор: Наталья 07 февраля 2019 Категория: Садовые растения

Пузыреплодник калинолистный (лат. Physocarpus opulifolius) – вид рода Пузыреплодник семейства Розовые, происходящий из Северной Америки. Научное название растения образовано сочетанием двух слов – physo и carpos, которые переводятся, как «пузырь» и «плод». В культуре вид с середины XIX века. В народе растение называют таволгой или спиреей калинолистной. Среди садоводов это растение слывет неприхотливым, но при этом оригинальным и привлекательным: кусты растения декоративны в течение всего сезона, поскольку красивы не только его соцветия, но также плоды и листья.

Содержание

Посадка и уход за пузыреплодником калинолистным

• Цветение: в июне-июле.
• Посадка: весной до начала сокодвижения или в октябре.
• Освещение: яркий солнечный свет.
• Почва: хорошо дренированная и не содержащая извести.
• Полив: саженцы поливают часто и обильно, взрослые растения – в среднем два раза в неделю при расходе 4 ведра на куст.
• Подкормки: два раза за сезон: в период распускания почек – азотным удобрением, осенью – раствором Нитроаммофоски.
• Обрезка: санитарная – ранней весной, до набухания почек, формирующая – после цветения. Живую изгородь обрезают в апреле и при необходимости еще раз, ближе к осени.
• Размножение: отводками, черенками, делением куста, реже – семенами.
• Вредители: практически не поражается.
• Болезни: хлороз.

Пузыреплодник калинолистный – описание

Пузыреплодник калинолистный представляет собой листопадный кустарник с поникающими ветками, бурой или коричневой корой, которая со временем начинает отслаиваться. Высота пузыреплодника калинолистного от 1,5 до 3 м. Листья растения округло-эллиптические или округло-яйцевидные, сверху зеленые, снизу более светлые, длиной до 4 см, с тупыми лопастями в количестве от 3 до 5 штук. Края листьев зубчато-пильчатые. Осенью листья желтеют.

Зацветает пузыреплодник калинолистный в июне-июле розовыми или белыми цветками, собранными в выпуклые щитки. Плоды представляют собой вздутые листовки, собранные в соплодия. Цвести и плодоносить пузыреплодник начинает с четырех лет. Живет кустарник около 30 лет.

Посадка пузыреплодника калинолистного

Когда сажать пузыреплодник калинолистный

Как и любые садовые кустарники, пузыреплодник калинолистный лучше сажать весной или осенью, но если вы приобрели саженцы с закрытой корневой системой, то посадку можно осуществлять в течение всего сезона вегетации.

Выращивать пузыреплодник калинолистный лучше на солнце, потому что в тени окрас его листьев не будет таким насыщенным. К почве у растения только два требования: наличие дренажа и отсутствие извести. Конечно, в плодородном рыхлом грунте растение будет выглядеть пышнее и наряднее, однако и при выращивании в бедной почве пузыреплодник тоже будет красив. Поскольку растение устойчиво к загазованности, его можно высаживать вдоль дороги.

Как посадить пузыреплодник калинолистный

Выкопайте заранее яму глубиной до полуметра. Дно ямы устелите слоем торфа или перегноя, установите на дно саженец вместе с земляным комом таким образом, чтобы после заполнения ямы плодородным грунтом корневая шейка оказалась на уровне поверхности. После посадки обильно полейте приствольный круг, а после того, как впитается вода, замульчируйте почву вокруг саженца торфом, перегноем или просто сухой землей.

Расстояние между кустами в групповых посадках или между пузыреплодником и другими растениями должно быть примерно 1,5-2 м. Если же вы высаживаете изгородь из пузыреплодника калинолистного, копайте ямы в два ряда, оставляя между рядами промежуток 35 см, а между ямами в ряду – 45 см.

Уход за пузыреплодником калинолистным

Посадка пузыреплодника калинолистного и уход за ним просты и не трудоемки. Вам придется, поливать растение, рыхлить вокруг него почву, удалять сорняки, по мере необходимости бороться с болезнями и вредителями, делать обрезку и вносить подкормки.

Полив

Только что посаженным растениям требуется частый и обильный полив. Вообще же регулярность поливов и количество расходуемой воды зависят от погоды, возраста растения и состава грунта. При выращивании пузыреплодника на суглинках в летнюю жару вам придется осуществлять полив два раза в неделю, расходуя по 4 ведра воды на каждый взрослый куст.

Кустарник пузыреплодник калинолистный, растущий на глинистых тяжелых почвах, переувлажнять нельзя, поскольку это может спровоцировать гибель корневой системы. Вода должна быть отстоянной и нехолодной, а после увлажнения желательно разрыхлить почву вокруг кустов и удалить сорную траву.

Подкормка

Подкармливают пузыреплодник калинолистный два раза за сезон: весной, в период распускания почек, в почву вносят азотные удобрения для роста вегетативной массы. Хорошо отзывается пузыреплодник на раствор 1 столовой ложки аммиачной селитры и такого же количества мочевины в 10 л воды с добавлением 0,5 л коровяка. Удобрение вносят под корень.

Осенью каждый куст подкармливают раствором 5 г (одного спичечного коробка) Нитроаммофоски в ведре воды, а норму для кустов старше 10 лет увеличивают вполовину. Взрослым кустам необходимо 10-15 л питательного раствора, а молодым достаточно 10 л. Весной приствольный круг мульчируют органическими материалами, например, торфом или перегноем.

Обрезка

Санитарная обрезка пузыреплодника калинолистного проводится весной: с кустов удаляют старые, больные, подмерзшие и поломанные ветки. Формирующую обрезку желательно делать после того, как куст отцветет. Естественная крона пузыреплодника калинолистного имеет фонтанообразную форму, поэтому для образования широкого и мощного многоствольного куста нужно обрезать растение на высоте 50 см, а если вы хотите придать растению более воздушный вид, оставьте только 5 наиболее развитых побегов, укоротив их до 1,5 м, а все остальные вырежьте до основания.

Кусты старше 5 лет нуждаются в омолаживающей обрезке, которую проводят осенью или ранней весной, и заключается она в удалении старых побегов до основания и обрезке остальных до того места, где отходит боковая ветка.

Живую изгородь стригут 1-2 раза за сезон, хотя при необходимости это можно делать и чаще. Первая стрижка проводится в апреле, до того, как начнут раскрываться почки.

Болезни и вредители

Пузыреплодник очень устойчив к болезням и вредителям, однако из-за недостатка в почве питательных веществ он может заболеть хлорозом, признаком которого является ухудшение состояния листьев: они желтеют, мельчают, скручиваются и опадают, а иногда могут усыхать и верхушки побегов.

Избавить пузыреплодник от проблемы может внесение в почву железа в той форме, в которой растение будет в состоянии его усвоить. Лучшими препаратами от хлороза являются Агрикола, Феррилен, Антихлороз, Феровит и Хелат железа.

Размножение пузыреплодника калинолистного

Пузыреплодник калинолистный можно размножать отводками, черенками и делением куста. Возможен и семенной способ размножения, при котором семена сеют под зиму на глубину 2-3 см, однако сеянцы очень редко наследуют родительские признаки, да и хлопот с их выращиванием слишком много. Поэтому чаще прибегают к вегетативному размножению.

Наименее трудозатратным способом является размножение отводками. Весной с низко растущего здорового побега удалите всю листву, оставив ее только на верхушке, уложите побег в заранее вырытую канаву глубиной 10-15 см, закрепите его в ней шпильками, оставив верхушку на поверхности и привязав ее к деревянному колышку. Чтобы прикопанная часть побега дала корни, нужно весь сезон увлажнять над ним почву, а следующей весной молодой кустик можно отсадить на постоянное место.

Для черенкования пузыреплодника нарезают побеги текущего года длиной около 20 см, с которых удаляют нижние листья, а верхние обрезают до половины. Нижний срез черенков можно слегка поскрести ножом, чтобы ускорить образования каллюса. Черенки ставят на сутки в ведро с водой, добавив в нее ложку меда или корнеобразователь, после чего высаживают под углом в 45 º в субстрат из торфа и песка и накрывают их прозрачной крышкой, полиэтиленовым пакетом или пластиковыми бутылками с обрезанным горлышком. На зиму черенки укрывают, а весной пересаживают на постоянное место.

Сорта пузыреплодника калинолистного

Пузыреплодник калинолистный имеет несколько садовых форм и множество сортов. Декоративные формы отличаются окраской листьев:

• лютеа – растения с золотисто-желтыми листьями;
• нана – форма высотой не более 1 м с темно-зелеными листьями;
• aureo-maiginata – пузыреплодники и золотисто-желтой каймой по краю зеленых листьев.

Сорта пузыреплодника тоже группируют по такой характеристике, как окраска листьев. Предлагаем вам описание сортов пузыреплодника калинолистного, которые выращиваются чаще других:

• пузыреплодник калинолистный Ауреа – кустарник высотой до 2,5 м с белыми цветками и ярко-желтыми в момент распускания листьями, которые в период цветения становятся зелеными, а потом снова желтеют, составляя контраст красным плодам;
• пузыреплодник калинолистный Пурпуреа, или пузыреплодник калинолистный Диабло – раскидистый кустарник высотой до 3 м с поникающими ветками, образующими полушаровидную крону, трех-пятилопастными зелеными листьями с незначительным пурпурным оттенком и многочисленными бледно-розовыми цветками, собранными в щитки. Плоды фиолетово-красные;
• пузыреплодник калинолистный Литтл Дэвил – кустарник высотой от 80 до 100 см с темно-пурпурными листьями, розовато-белыми цветками и красными плодами;
• пузыреплодник калинолистный Андре – кустарник с широкой раскидистой кроной, достигающий в высоту 2,5 м. Листья у него при распускании розово-красные, затем они становятся пурпурными с бронзовыми оттенком;
• пузыреплодник калинолистный Наггет – куст высотой до 2 м с вазообразной кроной и относительно мелкими, желтыми при распускании листьями, которые постепенно зеленеют;
• пузыреплодник калинолистный Лютеус – быстрорастущий кустарник высотой до 3 м с белыми цветками, желтыми с оранжевым оттенком листьями, которые летом становятся чуть зеленее;
• пузыреплодник калинолистный Дартс Голд – усовершенствованный сорт Лютеус: широкий и плотный куст высотой до полутора метров с ярко-желтыми в течение всего сезона листьями, которые летом чуть зеленеют. Цветки белые или розоватые;
• пузыреплодник калинолистный Леди ин Рэд – кустарник высотой 120-180 см с красноватой листвой и бледно-розовыми цветками, собранными в плотные щитки;
• пузыреплодник калинолистный Рэд Барон – компактный кустарник высотой до 2 м с розоватыми цветками и темно-красными глянцевыми, слегка сморщенными трехлопастными листьями с ярко-красным жилкованием и кроваво-красным отливом.

Востребованы в садоводстве и такие сорта пузыреплодника калинолистного, как:

• Сноуфолл,
• Саммер Вайн,
• Нанус,
• Винус,
• Амбер Джубили,
• Энджел Голд,
• Миндия (Коппертина),
• Сентер Глоу.

Пузыреплодник калинолистный в ландшафтном дизайне

Для украшения сада ландшафтные дизайнеры часто используют такой прием, как высаживание двух сортов пузыреплодника, контрастных по цвету: бронзовато-бордовый Рэд Барон и желто-лимонный Дартс Голд, например. Или пурпурный Диабл д’Ор и золотисто-зеленый Наггет. Их можно чередовать друг с другом в одном ряду или выращивать двумя параллельными линиями.

Не заднем плане миксбордеров и групповых посадок очень эффектно выглядят кусты сортов Диабло и Миндиа, которые прекрасно сочетаются с воздушным мискантусом китайским, лавандового оттенка перовскией и серебристым стахисом византийским. Для разграничения функциональных зон (отделения двора от огорода или для ограждения детской площадки, например) можно использовать бордюры из компактных сортов пузыреплодника:

Эти же сорта подойдут для оформления садовых дорожек, границ газона и обрамления входной зоны дома. Ну и, конечно, прекрасно выглядит живая изгородь из пузыреплодника калинолистного, для которой вам понадобятся высокорослые сорта растения.

Красавец пузыреплодник: выращивание и уход

Одно из, пожалуй, самых неприхотливых растений, в последнее время широко используемых в ландшафтном дизайне – это кустарник с интересным названием пузыреплодник. Давайте разберемся, как осуществляются посадка и уход за таким растением, как пузыреплодник калинолистный, и как использовать его в дизайне сада.

Пузыреплодник калинолистный: посадка и уход, фото интересных композиций в саду

Нетрудно догадаться, что название кустарника – говорящее, и дано растению из-за его своеобразных плодов, которые представляют собой небольшие шарики, с неровной, пузырчатой структурой. Если надавить на такой шарик, он легко лопается, издавая при этом характерный звук.

Пузыреплодник: описание, виды и сорта (фото)

Пузыреплодник (Physocarpus) – это листопадный кустарник семейства Розоцветных высотой 1,5 – 2 м. Насчитывается около 10 видов, куда входят довольно распространенный П. амурский (Ph. amurensis), П. стеллата Ph. stellatus и самый популярный нынче североамериканский вид — пузыреплодник калинолистный (Ph. opulifolius).

Внешний вид пузыреплодника — раскидистый, фонтанообразный кустарник, с довольно широкими плоскими листьями, окрас которых зависит от сорта и включает в себя всю градацию зеленого цвета (от ярко-желтого до темно-насыщенного зеленого), а также красно-багряные оттенки.

Украшением кустарника служат белые мелкие цветочки, собранные в небольшие красивые соцветия – шапки, их цветение продолжается два месяца – июнь, июль. А вот что касается окраски плодов пузыреплодника, то они постепенно меняют свой цвет в течение всего срока созревания – в самом начале имеют салатовый оттенок, а ближе к осени наливаются темно-бардовым.

Главная характеристика пузыреплодника, выделяющая его из собратьев – это свойство хорошо расти в тени. Его смело можно высадить на затемненных участках, куда практически круглосуточно падает тень от дома или забора, он также будет расти и цвести. Хотя, конечно, на солнце его листва более яркая, переливающаяся.

Легко кустарник переносит жару и от отсутствия частого полива точно не умрет, хотя воду любит. Пузыреплодник хорошо поддается стрижке, что делает его незаменимой частью ландшафтного дизайна. А поскольку кустарник быстро растет, то и восстановление после стрижки не занимает много времени.

Но пузыреплодник – это не только декоративное растение. В нем, а точнее – в его зелени, содержатся разные фенольные соединения и фенолкарбоновые кислоты, что дает возможность применять его в медицине.

Сортов пузыреплодника насчитывается множество, их объединяют в группы по цветовому признаку:

• Желто-зеленые пузыреплодники – Luteus, Darts Gold, Nugget, Nanus;
• Красные пузыреплодники – Schuch, Diabolo (Purpureus), Summer Wine, Red Baron, Little Devil, Little Angel;
• Смешанные двуцветные пузыреплодники – Coppertina, Center Glow, Jefam.

Но все они различаются не только цветом листьев, но и формой и оттенком цветочных шапок.

Посадка и размножение пузыреплодника: способы и особенности

Посадить на своем участке пузыреплодник – дело нехитрое. Главное, определиться, каким способом высаживать растение:

• Черенкование. Это самый действенный метод, исключая, конечно, готовое покупное растение в контейнере. Ведь магазинный саженец уже «готов», его лишь следует правильно посадить и обустроить в почве. А вот черенок это еще только потенциальный саженец, но все-таки.

При черенковании от уже растущего пузыреплодника (и если его еще нет, то можно позаимствовать у соседей или знакомых), следует брать на посадочный материал только побеги нынешнего года. Нарезка происходит острым садовым ножом. На черенке (20 см) должно остаться не менее двух междоузлий. После того, как черенки готовы, их помещают в симулятор роста, например, «корневин», и действуют согласно инструкции. Можно воспользоваться и народным методом – развести в ведре с водой ложку меда и оставить черенки в ней на сутки.

Черенок высаживают в горшок, или другую подобную емкость. Наполнение этой емкости – влажный и предварительно обработанный высокими температурами (прокаленный в духовке, например) песок и торф.

Влажность здесь – главный показатель, поэтому за ее уровнем надо тщательно следить, по крайней мере, до того, как произойдет появление первой почки. Укоренившиеся черенки высаживают на постоянное место следующей весной.

• Деление куста. Этот способ, как говорят профессионалы, самый легкий. Делят куст весной или осенью. Для этого его полностью выкапывают и разделяют на доли – каждая со своей корневой системой и побегами. Затем высаживают в подготовленные ямы. Главное, сделать это очень быстро, чтобы у кустов не подсохли корни в процессе пересадки на новое место.
• Отводки. Размножение пузыреплодника отводками осуществляют весной. Для этого выбирается самый крепкий и здоровый кустарник, для размножения берется побег с такими же характеристиками. С выбранного побега обрывается вся листва, кроме самой верхушки, там листья следует оставить. Ветвь пригибают к земле, выкопав в месте их соприкосновения углубление (10 см), и прикапывают. Для прямого роста лучше всего использовать колышек, к которому ее и привязать. Все лето этот побег следует обильно поливать, лишь в этом случае он даст хорошие корни уже к осени. Затем его выкапывают и высаживают на постоянное место. В первую его самостоятельную зиму обязательно укрывают.
• Семена – не лучший способ выращивания пузыреплодника, поскольку всходы из семян не наследуют декоративных характеристик материнского растения, к тому же с ними очень много возни. Перед посадкой, семена необходимо в течение месяца стратифицировать.

Посадка пузыреплодника в грунт: необходимые условия

При высадке саженца в открытый грунт, следует выполнить несколько условий.

Пузыреплодник к составу почвы практически равнодушен, он будет нормально расти на любой. Конечно, предпочтет рыхлые, легко пропускающие кислород и влагу, со слабокислым pH – здесь будет широко и быстро разрастаться, но и на других почвах при должных условиях будет расти не хуже. А один нюанс все-таки есть: кустарник не любит близость грунтовых вод и много извести также не переносит, может серьезно заболеть. В остальном пузыреплодник неприхотлив.

Перед посадкой, почву обязательно перекапывают, рыхлят, убирают все сорняки и остатки с прошлого года. Выкапывают под саженец яму 50×50 см. На дно ямы укладывают слой перегноя. Если растений предполагается несколько, то между ними выдерживают не менее 2-х метров, в противном случае они лишь будут мешать друг другу. Конечно, в случае выращивания живой изгороди, посадки делают чаще, 35-45 см.

Саженец пузыреплодника располагают в яме строго вертикально. Корни желательно расправить, насколько возможно. Затем их засыпают почвой, оставляя наружу корневую шейку. Землю утрамбовывают. Вновь высаженное растение поливают, а затем проводят мульчирование торфом.

Уход за взрослым пузыреплодником

Ошибочно думать, что если растение неприхотливо, то можно посадить и попросту забыть о нем. Пузыреплодник живет в среднем 30 лет, и уделять ему внимание все-таки надо.

Уход за пузыреплодником совсем не тяжелый и состоит из нескольких основных действий.

• Обрезка куста. Необходимая для растения обрезка – санитарная. Ее проводят в обязательном порядке каждой весной, и без сожаления состригают все больные, поврежденные, засохшие за зиму ветви. А вот на втором году жизни кустарнику потребуется стимулирующая обрезка. Что касается декоративной обрезки, то ее проводят по желанию, но лишь после того, как кустарнику исполнилось три года. Можно это делать как весной, так и в другое время, но только тогда, когда растение зацвело, до цветения делать этого не стоит. Чтобы пузыреплодник не выродился и не постарел, один раз в пять лет проводят его тотальную обрезку – под корень, оставляя лишь 20-ти сантиметровые пеньки.
• Поливу растения следует уделять повышенное внимание, он должен быть регулярным, особенно в период приживаемости куста. В повышенном поливе пузыреплодник нуждается на суглинистых почвах в жаркое лето. Здесь каждому кусту два раза в неделю будут просто необходимы 30-40 литров воды. В других случаях полив определяется самостоятельно – по состоянию земли. А вот на глинистых почвах следует быть осторожным – там может образовываться застой, что приводит к загниванию корней.
• Мульчирование для пузыреплодника, как и для любой другой культуры, позволяет создать оптимальную атмосферу для прикорневой зоны. Почва дышит, а значит, и корни растения получают кислород. Мульчирование создает правильный режим влажности, сглаживая ее скачки. Поэтому проводить эту процедуру следует почаще, и использовать для этого органику.
• Подкармливать пузыреплодник также нужно обязательно, только так он будет здоровым и веселым. Делают это в идеале два раза в год – после зимы (для стимулирования роста листвы) и перед зимой.
  • Для весны: В ведро воды добавляют ½ литра коровка (либо птичьего помета), 1 л сорнякового настоя. Либо используют другие азотные удобрения.
  • Для осени: В ведре воды настаивают 1 стакан древесной золы. Или используют другие минеральные удобрения (кто еще не перешел на органическое земледелие).

Приготовленными растворами осуществляют полив кустарника – 15 литров на одно растение.

Поскольку пузыреплодник достаточно устойчив к холодам и без проблем переносит зиму, то и в укрытии он не нуждается. За исключением первого года жизни, когда его корневая система еще не совсем окрепла.

Еще одним достоинством пузыреплодника является то, что он практически не болеет и никакой вредитель его не любит. Единственная болезнь, которая может появиться у кустарника – это хлороз, возникающий в связи с нехваткой питательных элементов в почве – железо, магний, азот. Исправить такую ситуацию легко – следует лишь осуществить подкормку комплексными удобрениями. Главное, вовремя заметить неладное.

Применение пузыреплодника калинолистного в ландшафтном дизайне

Это растение не зря широко используется в саду, ведь для ландшафтного дизайна оно подходит как нельзя кстати. И дело тут не только в неприхотливости и стремительном росте, а скорее в его художественном виде и разнообразии красок. Пузыреплодник меняет свой окрас в течение всего года, а это вносит разнообразие в общий вид сада. Также можно скомбинировать разные сорта растения и получить непередаваемую палитру цвета.

Пузыреплодник можно использовать как самостоятельное растение в композиции – и как центровое, и как вспомогательное. Он легко поддается обрезке, и ему можно придать практически любую форму. Хорошо комбинируется с хвойными. Также часто используют как фон для более мелких растений.

Но иногда неумело использованный пурпурный цвет в саду может создать иллюзию «провала», поэтому его обязательно нужно оттенить другими оттенками. Вот небольшая схема с примером что посадить рядом с пузыреплодником Диабло:

1. Вейгела цветущая ‘Пурпуреа Нана’;
2. Лиственница европейская ‘Репенс’;
3. Маргаритка многолетняя ‘Этна’;
4. Пузыреплодник калинолистный ‘Диаболо’;
5. Лапчатка кустарниковая ‘Принцесc’;
6. Рододендрон желтый;
7. Кипарисовик горохоплодный ‘Филифера Ауреа Нана’;
8. Можжевельник казацкий;
9. Можжевельник виргинский ‘Глаука’;
10. Скумпия обыкновенная ‘Роял Пёрпл’;
11. Сосна горная ‘Мугус’;
12. Сосна кедровая корейская ‘Глаука’.

Особенно великолепны из него живые изгороди – это не только красивые аккуратные сплошные ряды насыщенного цвета, но и защитники от пыли и грязи дорог.

По декоративным качествам и неприхотливости трудно сравнить этот декоративный кустарник с каким-либо другим, поэтому он все больше набирает популярность. Высаживайте у себя пузыреплодник калинолистный, посадка и уход за ним не доставят вам особенных хлопот, а фото композиций с его участием всегда будут яркими и даже можно сказать нарядными.

Пузыреплодник желтолистный: фото и описание сортов

Желтый пузыреплодник относится к категории неприхотливых садовых растений, которые сохраняют декоративность на протяжении всего сезона. А этими качествами отличаются немногие культуры. Помимо нарядной листвы, кустарник в период цветения образует щитковидные соцветия, что придает растению изысканности. Благодаря этому многие цветоводы предпочитают выращивать пузыреплодник желтый на своем участке, создавая контрастные композиции.

Чем примечателен желтолистный пузыреплодник

Это растение является листопадным кустарником и относится к немногочисленному семейству Розовые. Свое название культура получила благодаря вздутым плодам, открывающимся сверху. Высота кустарника достигает 1,5-3,5 м в зависимости от разновидности.

Пузыреплодник желтый выделяется не только окрасом листьев, но и густой пышной кроной. Листовая масса на побегах равномерно расположена по всей длине, поэтому кустарник выглядит объемно. Пластины трех- или пятилопастные с зубчатым краем и округлым основанием. По внешним признакам они напоминают листья калины или винограда.

Во время цветения на желтом пузыреплоднике появляются бело-розовые выпуклые соцветия диаметром 5-7 см. Этот период приходится на июнь-июль и продолжается 15-20 дней. Каждый цветок имеет множество тычинок, что создает впечатление пушистого шара.

В итоге образуются плоды-листовки на верхушках побегов, оттенок которых меняется по мере созревания. Изначально он зеленый, затем красный и в итоге становится коричневым. Такое контрастное сочетание с желтой листвой повышает декоративность кустарника.

Лучшие сорта желтолистного пузыреплодника

Существует несколько желтых видов этого кустарника. При их выведении селекционеры преследовали цель получить растения компактного размера с контрастным окрасом листьев. Но, несмотря на общие качества, каждый сорт золотистого пузыреплодника имеет определенные отличия, на которые необходимо обратить внимание при выборе для украшения участка.

Лютеус

Данный сорт характеризуется пышным раскидистым кустом, который достигает в высоту 2,5-3 м и в ширину 4 м. Но при проведении регулярной обрезки можно получить густую крону, что только улучшит декоративные качества пузыреплодника. Ветви растут вверх, но концы слегка ниспадают. Цветы имеют кремово-белый оттенок.

В начале вегетации листья у Лютеуса насыщенного желтого цвета, с наступлением лета они приобретают салатовый оттенок, а осенью становятся багряными. Пластины украшены резным кантом по краю.

По форме листья сорта Лютеус очень схожи с виноградными

Голд Спирит

Этот сорт пузыреплодника характеризуется желтым оттенком листьев. Взрослое растение отличается компактным размером и достигает в высоту не более 2 м. Легко переносит стрижку и быстро наращивает пышную крону.

Наггет

Данный вид был создан благодаря усилиям американских селекционеров. Высота взрослого пузыреплодника достигает 2,5 м.

Листья при распускании имеют ярко-желтый цвет, ближе к лету приобретают зеленый оттенок, а к осени опять становятся золотистыми. Размер пластин значительно меньше, чем у других калинолистных желтых пузыреплодников. Цветы у Наггета бело-кремовые.

От других видов Наггет отличается толстыми стеблями, которые растут исключительно вверх

Ауреа

Этот вид пузыреплодника характеризуется полушаровидной кроной с раскидистыми ветвями. Высота взрослого растения достигает 3 м. Цвет листьев меняется в зависимости от периода года. Весной оттенок желтый, летом – зеленоватый, а осенью – золотистый.

Цветы у Ауреа белые, диаметром – 1,2 см, с яркими многочисленными тычинками. Плоды при созревании становятся красными.

Ауреа наибольшие декоративные качества показывает при выращивании на открытом солнечном участке

Голден Наггет

Сорт характеризуется усиленным ростом побегов. Взрослый кустарник вырастает до 2 м, при этом диаметр куста также составляет 2 м. Окрас листьев у Голден Наггет, как и у многих других видов пузыреплодника, меняется на протяжении всего сезона. Изначально он насыщенно-желтый, затем становится салатовым, а ближе к осени приобретает первоначальный оттенок. Цветы у сорта Голден Наггет бело-розовые с приятным ненавязчивым ароматом.

Культура хорошо развивается и в полутени, но при этом листья не становятся ярко-желтыми

Энис Голд

Этот пестролистный сорт пузыреплодника отличается компактным размером куста высотой до 2 м и плотной густооблиственной кроной. Цвет пластин сохраняется на протяжении всего сезона. Листья окрашены в желто-зеленые штрихи, образуя своеобразный рисунок.

Несмотря на то что Энис Голд не характеризуется золотистым оттенком, от этого его декоративные качества не снижаются.

Энис Голд по форме листьев напоминает смородину

Эмбер Джубили

Сорт был получен британскими селекционерами. Взрослый кустарник этого сорта в высоту не превышает 1,5 м. Край листовых пластин зубчатый. Их окрас изначально пурпурно-желтый, затем меняется на зеленый и в конце сезона становится оранжевым.

Цветы белые, собраны в полушаровидные соцветия, которые из-за многочисленных тычинок выглядят пушистыми.

Эмбер Джубили был получен при скрещивании сортов Дартс Голд и Диабло

Дартс Голд

Голландский сорт пузыреплодника, характеризующийся компактной формой куста, высота которого достигает 1,5 м. Листья у этого вида при распускании имеют ярко-желтый цвет с оранжевым отливом, с приходом летней жары они становятся зелеными, и уже осенью еще раз меняют оттенок на багряный.

В июне на кустарнике появляются бело-кремовые щитковидные соцветия. Дартс Голд считается одним из самых популярных калинолистных пузыреплодников с золотистым оттенком листвы.

Этот гибрид был получен при скрещивании таких сортов, как Лютеус и Нанус

Энджел Голд

Этот сорт образует куст высотой 2-2,5 м. Ветви у него растут вертикально, слегка раскидистые. Листья в начале вегетации имеют лимонно-желтый оттенок, затем летом становятся зелеными, и уже осенью приобретают первоначальный оттенок. Растение отличается быстрым ростом.

Цветы у этого вида белые с розовым отливом. Плоды созревают в конце августа и долго держатся на побегах, повышая декоративные качества растения.

У пузыреплодника сорта Энджел Голд к осени по краю листовой пластины может появляться ярко-оранжевая кайма или штрихи по центру

Применение желтого пузыреплодника в дизайне

Согласно описанию, пузыреплодник желтый является самодостаточной культурой, и отлично смотрится в одиночных посадках на фоне хвойников. Но при этом его также можно сочетать с пурпурными видами культуры, используя в качестве живой изгороди.

С помощью этого растения можно поделить участок на зоны, и оформить бордюры. Особенность пузыреплодника в том, что это растение не страдает от выхлопных газов и пыли. Поэтому его можно использовать для озеленения городских парков и скверов, а также создать защитный барьер от близкорасположенной дороги.

Посадка и уход за пузыреплодником с желтыми листьями

Эта культура нетребовательна к составу почвы и при этом может расти на одном месте до 40 лет. Ежегодный прирост составляет около 40 см в высоту.

Размещать пузыреплодник необходимо на открытых солнечных местах, защищенных от сквозняков. При недостатке света окрас листьев не будет максимально ярким. Растение предпочитает суглинки с низким или нейтральным уровнем кислотности. При посадке в яму нужно внести смесь из дерна, перегноя и песка в пропорции 2:1:1. Также на дно следует уложить слой дренажа толщиной 5-7 см, что исключит застой влаги у корней.

У пузыреплодника сорта Энджел Голд к осени по краю листовой пластины может появляться ярко-оранжевая кайма или штрихи по центру

После этого присыпать корни землей, уплотнить поверхность почвы у основания и обильно полить. На следующий день прикорневой круг замульчировать торфом, чтобы воздух смог беспрепятственно проникать к корням.

При использовании культуры для живой изгороди саженцы следует высаживать в шахматном порядке, соблюдая расстояние 45 см, а междурядья оставлять шириной 35 см.

В дальнейшем необходимо следить за влажностью почвы, не допуская пересыхания и переувлажнения корней. Полив при отсутствии осадков следует делать 1-2 раза в неделю в зависимости от температуры воздуха и быстроты испарения.

Подкармливать саженцы рекомендуется с 3-летнего возраста. Для этого весной в период вегетации следует удобрять растения коровяком 1:10 или куриным пометом 1:20. А перед зимой поливать суперфосфатом 40 г и сернистым калием 30 г на ведро воды.

Для формирования красивого куста пузыреплодник желтый нужно регулярно обрезать, удаляя при этом поломанные и поврежденные ветви. Кроме того, при желании крону можно формировать в виде шара, цилиндра, а также для живой изгороди ровной линией.

Один раз в пять лет рекомендуется проводить омолаживающую обрезку, удаляя все старые побеги у основания

Особенности размножения

Размножать желтый пузыреплодник можно разными способами. Если необходимо получить небольшое количество новых саженцев, то можно использовать отводки или поделить взрослый куст.

В первом случае нужно ранней весной выбрать сильный нижний побег, пригнуть его к земле и уложить в ров глубиной 10 см. При этом верхушка должна остаться сверху. В течение всего сезона необходимо регулярно поливать. При правильном уходе побег укоренится к осени. Тогда его можно отсоединить от маточника.

Во втором случае получить новые саженцы пузыреплодника желтого не составит трудностей даже начинающему садоводу. Для этого нужно ранней весной или осенью выкопать материнский куст. Поделить его на части острым секатором, чтобы каждая деленка имела несколько побегов и хорошо развитые корневые отростки. После этого высадить их на постоянное место.

Деление куста желтого пузыреплодника рекомендуется проводить весной до начала вегетации или осенью после листопада

Вредители и заболевания

Желтый пузыреплодник обладает высокой устойчивостью к вредителям и заболеваниям. Но при чрезмерном увлажнении грунта куст может поражаться мучнистой росой. Распознают ее по белому налету на листьях, который впоследствии становится бурым. Заболевание препятствует процессу фотосинтеза и вызывает преждевременный листопад.

Для устранения мучнистой росы необходимо провести обработку куста любым из предложенных средств:

При недостатке питательных веществ желтый пузыреплодник может страдать от хлороза. Характерной особенностью болезни является обесцвечивание листовой пластины с четко выделяющимися прожилками на ней. Для устранения хлороза рекомендуется полить 2-3 раза кусты рабочим раствором препарата «Феровит».

Заключение

Желтый пузыреплодник – универсальная многолетняя культура, которая сохраняет декоративные качества на протяжении всего сезона. Применение кустарника в ландшафтном дизайне позволяет облагородить участок без особых усилий. При этом, сочетая красные и желтые виды, можно получить яркие акценты в саду, которые невольно будут притягивать взгляд.

Пузыреплодник калинолистный: сорта

Работу современных селекционеров можно сравнить с деятельностью революционеров-подпольщиков. Во всяком случае, конспирация является неотъемлемой частью их деятельности. Оно понятно, работа над сортом кропотлива и длительна. Сорт, если конечно это не случайная находка в природе, не может быть создан в одночасье. Его создание – не одномоментный акт, а длительная работа. Сорт надо сначала всесторонне проверить и испытать. Не исключено, что первое впечатление от него обманчиво, и это не слишком устойчивая мутация, склонная к реверсиям – возврату к дикой форме. В общем, трезвонить на весь мир, привлекать к себе внимание имеет смысл, когда уже никто и ничто не сможет помешать автору сделать на новичке деньги.

Как бы то ни было, пузыреплодник калинолистный «Диаболо» вошел в садовый обиход загадочным Мистером Икс. В сущности, в его появлении не было ничего сверхъестественного. Ведь пурпурный и желтый цвета самой природой заложены в зелени листьев, подобно тому, как белый свет вбирает в себя все цвета радуги. Самым ярким примером этого явления пока еще остается барбарис Тунберга. Но все идет к тому, что пузыреплодник скоро потеснит его на подиуме.

История появления «Диаболо» и сейчас представляется весьма туманной. Известно только, что появился он в Германии, отобран Х.Т. Шадендорфом в Эллербеке. В Европе «Диаболо» начал светиться с середины 1990-х. А на российском рынке первые саженцы «Диаболо» появились в самом начале XXI века. Он сразу заявил себя претендентом на звание самого яркого из пурпурных. Но не менее значимым его достоинством, несомненно, оказалась абсолютная зимостойкость.

Чтоб вы знали

Высота кустарника сорта «Diabolo» («Диаболо») достигает 2,5 м, при обычной ширине чуть более 1,5 м. Крона довольно плотная, слегка раскидистая. Листья по форме и размерам сходны с калиновыми. На открытом солнце они окрашиваются в свекольные и темно-пурпурные оттенки. В умеренной тени коричневеют, а в сильной становятся буровато-зелеными.

За свои декоративные достоинства «Диаболо» был удостоен нескольких наград. В 2002-м году ему была присуждена премия AGM (Award of Garden Merit) английского Королевского общества садоводов, которую присуждают самым выдающимся по декоративности и одновременно неприхотливым сортам. Небезынтересно узнать, что эту премию в разные годы получили еще два пузыреплодника: «Dart’s Gold» – в 1993-м и «Lady in Red» – в 2012-м.

«Диаболо» пробыл в центре внимания садоводов около полутора десятилетий. Благодаря этому сорту, возобновился интерес и к его желтолистному родственнику «Лютеусу», с которым, как оказалось, они образуют необыкновенно колоритные сочетания.

Основные сорта пузыреплодника

До появления пузыреплодника главным декоративно-лиственным кустарником в российском палисаднике был барбарис Тунберга. К моменту появления «Диаболо» у барбариса уже насчитывалось несколько десятков сортов с самыми разнообразными данными. Пузыреплодник уже изначально был лишен главного изъяна барбариса – недостаточной зимостойкости большинства сортов. Таким образом, чтобы побить своего соперника, ему следовало всего лишь обзавестись линейкой сортов. Но это легко сказать – никому и в голову не могло прийти, что такое возможно, ведь барбарис тоже не стоял на месте. Селекционеры уже давно навострились выпекать его новые сорта с завидной регулярностью.

Барбарис и сейчас по количеству сортов намного впереди, но разрыв между соперниками значительно уменьшился. И результат их соперничества не возьмется предсказать уже никто. К 2016 году число сортов пузыреплодника уже превысило три десятка. И, безусловно, это только начало, поскольку кустарник имеет большой неиспользованный генетический потенциал. Селекцией пузыреплодника занимаются усиленно по обе стороны Атлантики. В этом деле уже отметились Голландия, Германия, Франция, Англия, США. Очевидно, над кустарником работают и в других странах. Поэтому в ближайшие годы ожидается появление новых сортов с не существующими в настоящее время характеристиками.

• Diabolo(Диаболо) – плотный кустарник высотой до 2,5 м, при обычной ширине около 1,5 м. Листья формой и размером напоминают калиновые, при разной освещенности и в разных частях кроны темно-пурпурные, бордовые, красные, буро-зеленые. Хорошо восстанавливается после обрезки. Можно формировать и стричь.
• Luteus(Лютеус) син. Aureus(Ауреус) – кустарник высотой до 2,5-3,0 м, растет быстро. Листья при распускании желто-оранжевые, затем желтые.

• Dart’sGold(Дартс Голд), Голландия – гибрид сортов «Nanus» и «Luteus». Куст высотой до 1,5 м с плотной округлой кроной. Листья желтые, устойчиво сохраняют свой цвет практически весь сезон. Во второй половине лета слегка зеленеют, осенью приобретают бронзово-оранжевый оттенок. Цветки кремовато-белые.
• Summer Wine (СаммерВайн) син. Seward – куст высотой около 1,5м. Молодые листья темно-бордовые или вино-красные, с металлическим блеском. Летом слегка зеленеют.

• GoldSpirit(Голд Спирит) – кустарник высотой до 2 м. Листья золотисто-желтые весь сезон. Хорошо стрижется. Отличная альтернатива сортам «Aurea» и «Luteus».
• RedBaron(Ред Барон) – изящный ажурный кустарник высотой до 1,5 (2) м. Листья тех же оттенков, что и у Диаболо – от красно-пурпурных до бордово-коричневых, но чуть мельче и с более выраженными лопастями. Растет относительно медленно. Хорошо стрижется и формируется. Перспективен для невысоких декоративных стриженых изгородей.
• DiableD‘Or(Диабл Д’Ор) – куст высотой до 2 м. Листья красновато-пурпурные с темно-оранжевыми прожилками. Молодой прирост и листья в начале роспуска целиком оранжевые. Тыльная сторона листьев буровато-зеленая.
• RedEsquire(Ред Эсквайр) – сравнительно невысокий куст высотой 1,5 м. Листья некрупные, блестящие, темно-пурпурные, бордовые, коричневато-красные. Цветки розоватые.
• AmberJubilee(Амбер Джубили) – необыкновенно яркий, «празднично» окрашенный сорт. Кустарник высотой до 2 м, при ширине около 1,5 м. Листья на концах ветвей огненно-красные, красно-оранжевые. Ближе к центру кроны они постепенно приобретают желтые и зеленые оттенки со множеством переходов. При ветре листья колышутся, создавая эффект калейдоскопа. Наиболее ярко кустарник выглядит при посадке на открытом солнце. Сорт английский, назван в честь бриллиантового юбилея королевы Елизаветы Второй.
• AngelGold(Энжел Голд) – раскидистый куст с предельной высотой около 2,0 м. Листья как у природной формы или у Диаболо, в роспуске желтые, затем слегка зеленеющие, осенью снова желтые. Цветки белого цвета.
• LadyinRed(Леди ин Ред) – кустарник высотой около 1,5 м. Листья при распускании ярко-красные, к середине лета темнеют до свекольного. Цветки приятного розоватого оттенка, в плотных «шапочках».

• CenterGlow(Сентер Глоу) – куст имеет высоту до 2 м. Листья светло-бордовые или темно-красные. При роспуске с золотистым отблеском, затем постепенно темнеют. Необыкновенно ярок на просвет.
• LittleDevil(Литтл Девил) – плотный кустик высотой до 0,8-1,0 м при ширине около 70 см. Побеги в основном вертикальные. Листья пальчатые, до 4 см в поперечнике, темно-бордовые в течение всего сезона, изящные. Цветки мелкие, розоватые, в довольно рыхлых щитковидных соцветиях диаметром около 3-4 см. Перспективен для геометрических бордюров высотой до 40-50 см.

• Coppertina(Коппертина), син. Mindia (Франция) – кустарник высотой и диаметром кроны около 2 м. Листья в начальных стадиях развертывания желтовато-оранжевых, оранжево-красных и бронзово-красных оттенков. Впоследствии вишневые, темно-бордовые, коричневые. В затененных частях кроны буровато-зеленые. Считается одним из самых «красных» сортов.
• Chameleon(Хамелеон) – невысокий, слегка раскидистый куст высотой до 1,5 м. Листья темно-зеленые, пальчатые, с красными, желтыми, оранжевыми пятнами. Молодые листья имеют пурпурную кайму, которая затем становится салатной. Возможны реверсии – возврат листьев к темно-красной окраске. Такие побеги следует вырезать.
• Andre(Андре) – кустарник высотой 2-2,5 м при ширине до 1,5-2,0 м. Листья в роспуске оранжево-красные и розовато-красные, позднее бронзово-красные.

• Nugget(Наггет), США – куст высотой до 2,5м. Листья вначале ярко-желтые, а к середине лета в них появляется светло-желтая составляющая. Цветки кремово-белые.
• GoldenAnny(Голден Энни) – кустарник высотой чуть более 1,5 метра. Листья пастельно-зеленые с неравномерной кремово-желтой каймой по краю, и незначительными пятнами.
• Midnight(Миднайт) – кустарник высотой около 1,5 м, при ширине кроны до 1,8 м. Листья на концах ветвей темно-фиолетовые, ближе к центру кроны почти черные. Самый тёмный из пурпурнолистных сортов.
• Schuch(Шуч) – кустарник высотой около 1,5 м, при такой же ширине кроны. Молодые листья вишневые, затем становятся темно-пурпурными.
• LittleAngel(Литл Энжел) – карликовый сорт, высотой 60 см при ширине около 70 см. Выведен в Голландии. Крона плотная, подушковидная. Листья мелкие, вначале оранжевые, в полном роспуске коричневато-свекольные. Хорошо стрижется. Перспективен для топиарных композиций, основанных на сочетаниях цвета и формы.
• TildenPark(Тилден Парк) – плотный, слегка раскидистый многоствольный кустарник высотой до 150 см. Листья светло-зеленые, некрупные, гофрированные. Цветки белые. Хорошо стрижется и формируется. Перспективен для бордюров, низких изгородей и других стриженых форм.
• LittleRedJoker(Литл Ред Джокер) – кустарник высотой 90-100 см, до 70 см в ширину. Листья мелкие, гофрированные, вначале вишневые, позднее пурпурно-коричневые. Перспективен для невысоких стриженых бордюров.

Фото: Александр Смирнов, Максим Минин, Рита Бриллиантова

Растения для сада по почте

Опыт пересылки по России с 1995г.

Каталог в Вашем конверте или на сайте.

600028, г. Владимир, 24 проезд, д.12

Смирнов Александр Дмитриевич

Тел. 8 (909) 273-78-63

Пузыреплодник калинолистный посадка и уход в открытом грунте

Пузыреплодник – это вид лиственных растений, которые относятся к семейству Розоцветных, и успешно выращиваются при посадке и уходе в открытом грунте нашего климатического пояса. Яркой индивидуальностью этого растения является расцветка его листьев. Цвет листьев у большинства видов бывает бордового, апельсинового и стандартного зеленого цвета.

У растения хрупкие стебли, диаметр которого около 2 см. Корневая система располагается в верхнем слое почвы, и предпочитает частое увлажнение. Растение хорошо переносит жаркую погоду и не боится открытых солнечных местностей. Родиной этого растения является Северная Америка, Корея и Восточная Азия. Цветение у растения длится около 30 дней. Цветки у пузыреплодника мелкие и белого цвета.

Сорта и виды

Пузыреплодник «Диабло» или пурпурный привлекает внимание листвой темного бордового оттенка и является отличным решением в садовом дизайне.

Пузыреплодник «Ред барон» листья у этого вида немного узковатые, в отличии от Диабло. Листовая пластина на поверхности украшена броскими прожилками алого оттенка. Растение в высоту может достичь двухметровой высоты. Цветение не длительное, но с выраженными розоватыми цветочками.

Пузыреплодник «Калинолистный» имеет несколько сортов. Куст в высоту может достигать до 3,5 метров с разложистыми хрупкими стеблями и не долговечной корой, которая осыпается со стволов. Форма листа у пузыреплодника похожа на эллипс и с зазубринами по краю. У этого вида цветки белые или с розовым оттенком.

Пузыреплодник «Краснолистный» популярен в выращивании. Этот вид хорошо переживает зимы, не требователен в уходе. Листва средних размеров по канту с зазубринами. Оттенок листьев весной алого цвета, а с наступлением холодов принимает бордовый оттенок. Цветки имеют нежный розовый оттенок. В дизайне сада ярко смотрится в виде живого ограждения.

Пузыреплодник «Наггет» имеет хрупкие побеги, которые тянутся к верху. Это гибридный сорт, который меняет оттенок листьев от поры года. Вначале листва имеет солнечный оттенок, к осени переходит в зеленый цвет.

Пузыреплодник «Дартс голд» у этого сорта вначале листья имеют желтый оттенок, а со временем с наступлением холодов переходит в огненный. Соцветия имеет светлый оттенок.

Пузыреплодник «Лютеус»

По внешнему виду напоминает виноградный куст. Высота растения достигает до 2,5 метров. Оттенок листьев у этого сорта желтый, но со временем переходящий в салатовый. Листья эллиптические и с кантом по краю. Этот сорт плохо переносит излишнюю влагу в почве.

Пузыреплодник золотистый или желтый. Листья у растения насыщенного солнечного оттенка вначале сезона, а с наступлением холодов становится золотистым. Высота куста около 1, 5 метров, а в диаметре куст около метра.

Пузыреплодник «Леди ин ред» высота растения около полутора метра, а в диаметре около 1,2 м. стебли растут вверх, поверхность побегов имеет шоколадный оттенок. Листья глянцевые вначале алого оттенка, а осенью становятся огненно каштановые.

Пузыреплодник «Эмбер Джубили» этот сорт был назван в честь Королевы Елизаветы по поводу ее юбилея. Высота растения около 2 метров, в диаметре около 1,5 метра.

Стебли у этого сорта растут вверх в конечном итоге образующие шарообразную форму. Оттенок листьев переходящий вначале имеет солнечный оттенок, а в конечном итоге светлый лимонный с зеленоватым оттенком. Соцветия белого оттенка.

Пузыреплодник «Тини вайн» этот сорт относится к карликовому виду, и его длина может достигать только до 1,2 м. листья яркие и обворожительные с бордовым оттенком. В весенний период растение радует взор своим цветением. Цветки имеют нежный розовый оттенок.

С наступлением холодов листья у растения становятся алого огненного оттенка. Этот вид довольно неприхотлив в уходе и хорошо переживает зиму и летнюю жару.

Пузыреплодник посадка и уход в открытом грунте

В уходе растение довольно не прихотливое, и не требует к себе особого внимания.  Но если предоставить пузыреплоднику соответствующие условия содержания, то растение за период активного развития, то есть за лето может добавить до 40 см в росте. Но для формирования нужной формы вашему кустарнику следует подрезать побеги. Эта процедура также, стимулирует появление новых стеблей.

При поливе следует учитывать состав почвы. Если грунт рыхлый, то он быстро пересыхает, поэтому и полив ему требуется частый и обильный. Количество воды зависит от размера вашего кустарника.

Если же почва глинистая, то необходимости следить за тем, чтобы не было застоя в почве, поскольку это грозит заражением мучнистой росой, из-за это растение постепенно погибает.

Подкормку для пузыреплодника производят весной и поздней осенью. Ранней весной эту процедуру проводят удобрениями с содержанием азота, а с наступлением холодов необходимы растению минеральные удобрения.

В весенний период можно удобрять коровьим пометом в соотношении на 10 литровое ведро 500 грамм помета и ложка селитры с содержанием аммиака.

Обрезка пузыреплодника

Растению необходима обрезка в лечебных целях и для красивого формирования куста. Обрезка в лечебных целях производиться ранней весной пока у растения не появились почки. Необходимо удалить сломанные, сухие и подмерзшие после зимы кончики ветвей.

Обрезка пузыреплодника летом происходит вынужденная, если на растении появились сухие ветки и необходимо удалить отцветшие сухие соцветия.

Как обрезать пузыреплодник осенью

Если вы хотите крепкий и большой куст необходимо обрезку производить на высоте около 50 см. Этот тип обрезки поможет сформировать множество новых побегов. Но если вы желаете придать вашему кусту определенную фонтанообразную форму. То необходимо срезать с куста все тонкие ветки и оставить только самые плотные и устойчивые побеги.

Омолаживание растению следует производить примерно на шестой год после высадки. Для этого следует вырезать все побеги до основания.

Пересадка пузыреплодника

Пересадку растению производят в весенний период или пересадку пузыреплоднику производят осенью, после осыпания листьев.

Перед пересадкой стебли у растения следует обрезать сантиметров на 40, в зависимости от высоты вашего растения. Это необходимо, чтобы у растения легче прошел период адаптации на новом месте.

Куст нужно выкопать вместе с большим земляным комом и пересадив на новое место. Увлажните корни раствором со стимулятором роста корней.

Размножение пузыреплодника

Размножение пузыреплодника семенами производят очень редко. Поскольку сеянцы из семян не наследуют практически насыщенный окрас листвы, а трата времени большая. Но все же, перед засевом семена следует стратифицировать.

Сеять следует в легкий грунт торфа с содержанием песка весной или осенью после сбора семян. После этого прикрыть емкость стеклом или пленкой. Периодически увлажняя и проветривая. После появления всходов и первых пар листьев саженцы следует пикировать.

Как размножить пузыреплодник черенками

Размножение пузыреплодника черенками можно производить весной, летом и осенью. Черенок нужно срезать с растения взрослого и крепкого. Длина черенка около 10 см и с несколькими явными почками.

С черенка необходимо удалить нижние листочки обработать его стимулятором роста и углубить в почву с составом торфа и песка. Саженцы следует прикрыть пленкой. Ухаживать необходимо с помощью увлажнения и проветривания собравшегося конденсата. После укоренения их необходимо пересадить на постоянное место.

Размножение пузыреплодника отводками

Самый легкий способ размножения. С началом весеннего тепла, необходимо выбрать самый крепкий стебель от взрослого материнского растения и прикопать его на глубину около 15 см, предварительно закрепив скобой.

В течении лета следует орошать, поливать и удалять сорняки вокруг отводки. А после укоренения нужно отделить отводку от матери и прикрыть на зиму.

Пузыреплодник размножение делением куста

Для этого необходимо выкопать растение и разделить на доли с полноценными побегами и корневой системой.

Производить эту процедуру необходимо в течение теплого летнего сезона. Только нужно не давать возможности подсохнуть корневой системе.

Болезни и вредители

• Почему у пузыреплодника сохнут листья – причиной может быть недавняя пересадка и плохая адаптация, поэтому необходимо обработать корни стимулятором роста.
• У пузыреплодника сохнут края листьев – причиной этому может быть излишнее солнце. Поэтому края листьев начинают подсыхать, то есть обжигаться.
• Пузыреплодник темнеют края листьев – ваше растение поражает мучнистая роса, причина застой влаги в почве.
• Пузыреплодник желтеют листья – причина недостаток питательных веществ в почве. Необходимо подкормить растение азот содержащими удобрениями.
• Почему не цветет пузыреплодник – причиной может неправильная обрезка растения. Поскольку соцветия образуются на новых сформировавшихся побегах.
• К вредителям растение довольно устойчивое и редко поражается насекомыми.

Пузыреплодник калинолистный Лютеус (Physocarpus opulif. Luteus)

Прекрасный кустарник для тех, кто не любит постоянства. Меняет свою окраску в соответствии с сезоном. Отлично подходит для создания великолепных живых изгородей и контрастных групп.

Диаметр кроны взрослого растения (м): 3

Высота взрослого растения (м): 3

Описание

Абсолютно неприхотливое, очень эффектное и быстрорастущее растение. Хорошо переносит городскую загрязненность. Прекрасный кустарник для тех, кто не любит постоянства: меняет свою окраску в соответствии с сезоном. Декоративен в течение всего вегетационного периода изменяющей окраску листвой, цветами и плодами. Рекомендован для широкого применения в озеленении города и частных садов. Способен в течение 2–3 лет закрыть проблемные места, создать контрастный элемент в сложных композициях, особенно с пузыреплодником калинолистным Диабло. Живые изгороди из него очень красивые, плотные и лёгкие в уходе.

Крона Раскидистый куст с поникающими ветвями, образующими густую, полушаровидную крону.

Хвоя/Листва Листья 3-5 лопастные. Весной – желтые с оранжевым оттенком, летом зеленеют, осенью — золотистые.

Цветение Цветы многочисленные, белые, собранные в щитках (до 5см). Цветет 2-3 недели.

Время цветения

июнь,

Плоды Плоды — сборные (вздутые листовки), красноватые

Требования Предпочитает солнечные места, выносит полутень и тень, теряя только интенсивность окрашивания. К почве не требователен, но предпочитает суглинистые кислые. Растёт на всех типах почв, которые в меру увлажнены и имеют хороший дренаж.

Посадка Перед посадкой корни замачивают в воде на 2–5 часов. В посадочную яму глубиной 60 см насыпают горкой питательный грунт. Затем помещают туда куст, расправляют корни и, не заглубляя корневую шейку, засыпают почвой и уплотняют. Обильно проливают почву.
Контейнерные растения можно сажать весь сезон. Посадку растений с голым корнем проводят ранней весной, до распускания листьев, или осенью, в сентябре.

Уход

Уход заключается в периодических поливах, подкормках, рыхлении почвы и в обрезке старых побегов.
Не выносит застоя влаги.
Морозостоек, но могут подмерзать молодые побеги.
Удобряют весной – в ведро воды добавляют ½ литра коровяка (либо птичьего помета), 1 л сорнякового настоя или используют другие азотные удобрения. Осенью – в ведре воды настаивают 1 стакан древесной золы или используют другие минеральные удобрения. Приготовленными растворами осуществляют полив кустарника – 15 литров на одно растение.
Устойчив к вредителям.
Устойчив к болезням.

Размножение Размножается черенками, делением куста, отводками, семенами.

Пузыреплодник золотист. Ауреус и красный Диаболо | Festima.Ru

Haличиe,paзмеры,cтоимость,уточняйтe по тeлефону или в личныe соoбщения. Mнoгoлeтники: Aнeмoна китайская (бeлaя ,cиpеневая ,жeлтая),Аpaбиc белый махpовый ,Арункуc ,Acтильбa (сиренeвaя высoкая ,темнo кpacная cрeдняя ,белaя cрeдняя),Бaдан, Бaрвинок(зелeный, пестpолиcтный),Бруннера пeстролистная, Горец пестролистный, Живучка 4 сорта ,Дельфиниум голубой и синий ,Дицентра (розовая, белая, коралловая, красная),Импирата, Ирис в ассортименте, Камнеломка белая, Лаванда(сиреневая, белая), Лиатрис сиреневый и белый, Лилейник в ассортименте ,Лихнис малиновый, Мискантус голубой и Зибрина, Молодила в ассортименте ,Обриетта синяя, Овсяница голубая и зеленая, Опунция, Очиток в ассортименте, Папоротник Страусник,Роджерсия конскокаштанолистная и Элегант , Хоста в ассортименте 90 сортов , Эхиноцея (красная махровая, лосось махровая, лечебная) ,Юкка нитчатая ,Ясенец сиреневый Лианы: Девичий виноград,Жимолость(Брауна,Серотина,Тельманна,Пестролистная),Кампсис. Декоративные деревья и кустарники: Барбарис (Тунберга, Ауреа, Арлекин, Голден Ринг, Блестящий краснеющий), Бересклет Форчуна(белый,желтый),Бузина Черная, Вейгела (Ранняя, Металик, Олимпиада, Хамелион),Гортензия крупнолистовая розовая, метельчатая(Грандифлора, Ваниль Фрайз, Мега Минди, Даймонт Руж, Лаймлайт, Пинки Винки,чисто белая крупная)Древовидная Инвизибелл, Дейция (Изящная, Шершавая, Пестролистная, Ягодная) ,Жасмин (Махровый, Пестролистный),Зверобой Повислый, Керрия Пестролистная,Кольквиция, Лапчатка( Желтая, Розовая, Белая, Желтая крупноцветковая), Магония Падуболистная, Пузыреплодник(Ред Барон, Дьябло),Роза почвопокровная (белая махровая, малиновая махровая), Самшит,Спирея(Голд Флэйм, Голд Принцес, Шарабана, Принцесса, Криспа), Форзиция Пестролистная и Сетчатая Хвойники: Кипарисовик (Эльвуди, Булевард шарик, Булевард колонка) Можжевельник(Стрикта, Казацкий, горизонтальный Голубая звезда, горизонтальный зеленый,раскидистый высотой 60 см зеленый с желтыми кончиками, раскидистый высотой 50 см золотистый, Вересковидный голубой, Горохоплодный, Сентинел ),Тис ягодный ,Туя (Западная золотокончиковая, Золотокончиковая до 2 метров ,Эльвангера, Даника).

Растения

Контуры патологии — Семенные пузырьки / семявыбрасывающий проток

Предстательная железа и семенные пузырьки

Доброкачественные имитаторы карциномы

Семенные пузырьки / семяизвержение

Тема завершена: 1 декабря 2015 г.

Незначительные изменения: 12 апреля 2021 г.

98 PathologyOutlines.com, Inc.

PubMed Search: Семенной пузырь [И] семяизвержение [название]

Просмотры страниц в 2020 году: 3531

Просмотры страниц в 2021 году по настоящее время: 2396

Цитируйте эту страницу: Matoso A.Семенные пузырьки / семявыбрасывающий проток. Сайт PathologyOutlines.com. https://www.pathologyoutlines.com/topic/prostateseminalves.html. По состоянию на 18 августа 2021 г.

Определение / общее

• Семенные пузырьки — это пара желез, расположенных ниже мочевого пузыря и связанных с основанием простаты.
• Они имеют форму трубки и могут складываться, образуя дивертикулы или выпуклости внутри стенки.

Основные характеристики

• Эпителий семенных пузырьков / семявыбрасывающего протока обнаруживает ядерную атипию, которая является дегенеративной по своей природе; также желтый пигмент в цитоплазме
• Выпячивание эпителия семенных пузырьков может дать начало скоплениям небольших желез, имитирующих рак простаты.
• Ключ к дифференциальному диагнозу заключается в распознавании дегенеративной ядерной атипии, характерного желтого пигмента и близлежащего эпителия семенных пузырьков.

Клинические особенности

• Семенные пузырьки могут быть источником гипердиагностики, если они присутствуют в образцах игольной биопсии простаты или образцах ТУР

Микроскопическое (гистологическое) описание

• Семенной пузырек имеет толстую мышечную стенку, сложные складки слизистой оболочки, столбчатые и базальные клетки
• Цитоплазма с крупными крупными золотисто-желто-коричневыми липофусцином / липохромными гранулами.
• Столбчатые клетки также имеют атипично выглядящие «гигантские» клетки с выраженной ядерной атипией и дегенеративным внешним видом, могут содержать гиалиновые глобулы (дегенеративные) (Am J Surg Pathol 1981; 5: 483)
• Гранулы пигмента липохромов могут быть 1-го типа (грубые, золотисто-желто-коричневые, обычно в большом количестве, обычно в эпителии семенных пузырьков / семявыбрасывающего протока) или 2-го типа (мелкие, серо-коричневые или темные и скудные, иногда присутствующие при аденокарциномах предстательной железы или ацинусы нормальной предстательной железы, Arch Pathol Lab Med 1999; 123: 1093, Hum Pathol 1995; 26: 1302)

Микроскопические (гистологические) изображения

Предоставлено Андресом Матосо, М.Д.

Простаты

Ядерный плеоморфизм

Желтый пигмент

Положительные окраски

• MUC6 и PAX2 положительны в семенных пузырьках и отрицательны в предстательной железе
• ПСА и ПСАП могут быть положительными как в семенных пузырьках, так и в предстательной железе

Дифференциальный диагноз

• Аденокарцинома простаты:
  • Выпячивание эпителия семенных пузырьков может дать начало скоплениям небольших желез, имитирующих рак простаты
  • Ключ к дифференциальному диагнозу заключается в распознавании дегенеративной ядерной атипии, характерного желтого пигмента и близлежащего эпителия семенных пузырьков.
    • Иммуногистохимия для MUC6 или PAX2 может помочь при необходимости

Вернуться наверх

Наночастицы золота изменяют свойства мелких внеклеточных везикул эмбриональных стволовых клеток мыши

Наночастицы золота (AuNP) вызывают значительный интерес в подавлении миграции опухолевых клеток, в то время как небольшие внеклеточные везикулы (sEV) играют важную роль в метастазировании опухоли, формируя микроокружение опухоли.Понимание того, как AuNP изменяют атрибуты sEV, имеет решающее значение при разработке противоопухолевых препаратов. В этом исследовании эмбриональные стволовые клетки мыши (mESC) обрабатывали AuNP трех размеров (, т.е. , AuNPs, 20 нм, AuNPs, 80 нм), чтобы получить sEV (, т.е. sEV-5, sEV-20, и sEV-80), которые были охарактеризованы с биофизических и протеомных аспектов. По сравнению с контролем (sEV-ctrl) sEV-5 обладал относительно более высокой жесткостью и дифференциально экспрессируемым белковым профилем.Он ослаблял пролиферацию и миграцию опухолевых клеток 4T1 за счет ингибирования экспрессии кофилина и фосфорилирования внеклеточной регулируемой протеинкиназы (Erk), что было противоположно эффекту, индуцированному sEV-ctrl. Напротив, sEV-20 и sEV-80 имели незначительные эффекты. Это исследование впервые показало, что воздействие AuNP-5 изменяет биофизические свойства и клеточные функции sEV, происходящих от mESC, обеспечивая многообещающую стратегию для разработки противоопухолевых препаратов на основе AuNP.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуй еще раз?

Нано-био взаимодействий внеклеточных пузырьков с золотыми наноостровками для ранней диагностики рака

Внеклеточные везикулы или экзосомы представляют собой инкапсулированные в мембрану биологические нанометрические частицы, секретируемые практически всеми типами клеток во всем животном царстве.Они несут груз активных молекул к проксимальным и дистальным клеткам тела в качестве механизма физиологической коммуникации, чтобы поддерживать естественный гомеостаз, а также патологические реакции. Экзосомы обладают огромным потенциалом для жидкостной биопсии и терапевтического применения. Таким образом, во всем мире существует потребность в простых и надежных методах выделения экзосом, которые поддаются диагностике на месте и контролю качества производства терапевтических экзосом. Это может быть достигнуто путем молекулярного профилирования экзосом для использования с определенными наборами молекулярных маркеров для диагностики и контроля качества.Жидкая биопсия, несомненно, является наиболее многообещающим методом диагностики для продвижения «персонализированной медицины». В настоящее время жидкая биопсия основана на циркулирующих раковых клетках, внеклеточной ДНК или экзосомах. Экзосомы потенциально открывают возможность диагностики на ранней стадии; Чтобы облегчить превосходную диагностику и изоляцию экзосом, разработана новая платформа для их обнаружения и захвата на основе локализованного поверхностного плазмонного резонанса (LSPR) золотых наноостровков за счет сильного сродства между экзосомами и пептидом, называемым венцеремин или Vn96.Физическое моделирование, основанное на характеристиках золотых наноостровов и биоэлементов, участвующих в зондировании, также разработано для определения способности платформы к обнаружению, которая оптимизируется экспериментально на каждом этапе. Предварительные результаты и моделирование представляют взаимосвязь между плазмонным сдвигом и концентрацией экзосом и, по сути, указывают на возможности ранней диагностики без меток.

1. Введение

Экзосомы или внеклеточные везикулы являются жизненно важными источниками биомаркеров рака и других патологических состояний, таких как воспалительные и нейродегенеративные заболевания, а также для клинической диагностики.Они представляют собой связанные с мембраной наноразмерные органеллы внеклеточной коммуникации, которые высвобождаются практически из всех типов клеток во внеклеточное пространство, транспортируя груз активных молекул (ДНК, РНК, белки / ферменты, липиды и метаболиты) в соседние и дистальные части тела и представляют собой снимки физиологического / патологического статуса исходных клеток в реальном времени. Они присутствуют во всех жидкостях организма, включая мочу, кровь, асцит, спинномозговую жидкость и сперму. Когда клетки культивируются в лабораторных условиях или в условиях биореактора, клетки выделяют свои экзосомы в используемые культуральные среды, называемые кондиционированными средами.Экзосомы в большинстве своем имеют сферическую форму, а их диаметр колеблется от 30 до 100 нм, что примерно в сотни раз меньше, чем у самой маленькой клетки [1–6]. Экзосомы образуются за счет почкования внутрь просветной мембраны мультивезикулярных телец и конститутивно высвобождаются путем слияния с цитоплазматической мембраной. Среди активных молекул груза белки теплового шока (такие как HSP70), как было показано, связаны как с мембраной экзосом, так и внутри [7–13]. Очевидно, что при многих раковых заболеваниях (например, молочной железы и яичников) концентрации всех раковых клеток и их HSP, связанных с экзосомами, повышены [14] и участвуют в различных аспектах биологии рака.

Обнаружение, выделение и характеристика экзосом по-прежнему являются сложной задачей из-за естественной сложности жидкостей организма. По этой причине необходимы универсальная платформа и простой в использовании метод для адекватного и выборочного обнаружения, выделения, количественной оценки и характеристики экзосом для клинического применения. Учитывая растущее количество доказательств того, что экзосомы могут быть лучшими жидкими исходными материалами для биопсии для идентификации и обнаружения биомаркеров, существует большой спрос на их простое, надежное и эффективное выделение / обнаружение из биожидкостей.Однако доступные в настоящее время методы выделения экзосом основаны на преципитации (ультрацентрифугирование и использование полиэтиленгликоля), которые не подходят для клинической диагностики на месте (POC). Ультрафильтрация дает относительно чистые экзосомы, но это технически сложно. Для разработки рутинной диагностики POC на основе экзосом технологически желательным является захват экзосом на основе аффинности. Большинство основанных на аффинности методов захвата экзосом основаны на моноклональных антителах, направленных против поверхностных маркеров экзосом [15–18], что приводит к повышению стоимости производства и несогласованности в анализах, таких как вариации антител от партии к партии.Захват аффинности на основе антител и выделение всех других экзосом на основе преципитации облегчают захват всех экзосом, присутствующих в данной жидкости, без дифференциации здоровых и больных (раковых) экзосом. Довольно сложные микро- и наносистемы привлекли внимание в последние годы своей высокой чувствительностью к обнаружению экзосом. Среди них — подходы, основанные на электрохимии, с использованием электроактивных молекул, меченных детектирующим антителом, а захваченные экзосомы обнаруживаются электрохимическим зондированием [19–21].Также сообщалось о наноплазмонных сенсорах и платформах для анализа микрожидкостных экзосом, имеющих функционализированный антителами канал [22, 23]. Несмотря на достижения в методах обнаружения экзосом, из-за сложности и неоднородности состава экзосом ни один из существующих методов не может рассматриваться как общий метод, который можно использовать для обнаружения экзосом как в клинических целях, так и в исследованиях. Проблемы бывают как технические, так и биологические, и любой шаг к их решению полезен.Разработка методов обнаружения экзосом — это непрерывный процесс, и есть еще много возможностей для улучшения.

Мы использовали синтетический пептид (Venceremin или Vn96), имеющий высокое сродство к каноническим HSP [24, 25], в качестве инструмента для захвата экзосом для платформы, описанной в этой работе. Рациональное использование аффинного захвата экзосом на основе Vn96 для диагностической платформы POC заключается в том, что раковые клетки и их экзосомы сверх экспрессируют HSP в своем просвете, а также на своей поверхности [26], но только на минимальном уровне в здоровых клетках или их экзосомах. .Также очевидно, что раковые клетки выделяют большее количество экзосом по сравнению с нормальными клетками, участвующими в прогрессировании опухоли [15, 27, 28]. Таким образом, Vn96 обеспечивает более сильное сродство захвата канонических HSP-сверхэкспрессированных (из раковых клеток) экзосом из данной жидкости организма на наноплатформах с привитым Vn96 и, таким образом, может обеспечить превосходную диагностическую ценность для ранней диагностики рака [24].

Хотя важно охарактеризовать экзосомы по их молекулярному составу, в настоящее время растет потребность в точном методе определения абсолютной концентрации экзосом в жидкостях организма для потенциальной диагностики ПОУ.Для этой цели появились поверхностные методы обнаружения, такие как поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и, совсем недавно, локализованный поверхностный плазмонный резонанс (LSPR), в дополнение к проточной цитометрии [29], настраиваемому резистивному импульсному зондированию (TRPS) и Анализ отслеживания наночастиц (NTA).

LSPR — одно из важнейших оптических свойств наноструктур золота и серебра. Это происходит, когда колебания свободных электронов проводимости наночастиц резонируют с падающим светом.Как положение, так и интенсивность полосы LSPR зависят от размера и формы наночастиц, и они очень чувствительны к диэлектрическим свойствам окружающей среды.

Платформы на основе золотых наноостровков и серебряных наноостровов использовались для многочисленных приложений зондирования [30–36]. В данной работе мы использовали метод термоконвекции для создания наноостровков на стеклянных подложках [33, 34]. Мы использовали особую химию для ковалентного присоединения стрептавидина к наноостровкам с последующей трансплантацией биотинилированного пептида Vn96 для создания плазмонной поверхности, на которой будут захватываться экзосомы.

Целью настоящего исследования является определение способности обнаружения платформы наноостровков Vn96-gold путем физического моделирования. Плотность молекул Vn96-пептида, которые могут быть размещены на этой платформе, была оценена, и соответственно были оценены концентрации стрептавидина, биотина-Vn96 и экзосом. В то же время различные этапы протокола зондирования обсуждаются с точки зрения последовательных событий связывания и их влияния на весь процесс обнаружения.Насколько нам известно, это новый подход к оценке эффективности платформы зондирования наноостровов, предназначенной для многоэтапного захвата и обнаружения экзосом. В попытке найти новую информацию, которая была бы полезна для диагностики ПОК на основе экзосом, мы попытались найти корреляцию между экспериментальными значениями сдвига полосы Au-LSPR и количеством экзосом в кондиционированной среде клетки рака молочной железы. линия. Эта работа по моделированию очень полезна при оценке морфологии новых структур для данного размера и концентрации экзосом или любых других биомолекул.

2. Результаты и обсуждение

2.1. СЭМ-исследование золотых наноостровков

Золотые наноостровки на стеклянных подложках, сформированные после отжига, были охарактеризованы с помощью изображений сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). На рисунках 1 (а) и 1 (б) показаны СЭМ-изображения агрегатов золота до отжига и наноостровки, полученные после отжига, соответственно. Из изображений видно, что отжиг при 560 ° C в течение 1 часа изменяет морфологию агрегатов наночастиц золота на наноостровки.Изображение ПЭМ показывает, что большинство островов имеют форму эллипсоида и широкое распределение по размерам.

2.2. Анализ изображений золотых наноостровов

СЭМ-изображение наноостровов анализируется с помощью аналитического программного обеспечения ImageJ (Wayne Rasband, NIH, США) для определения размеров островов и их поверхностной плотности. Для анализа рассматривается площадь 3,2 мкм м x 2,4 мкм м с 20 островками. Были проанализированы наноостровки, измерены их средняя длина и ширина, а также рассчитаны средние расстояния между островами с использованием расстояния от центра до центра между ближайшими соседними островами.Максимальная и минимальная длина наноостровков оказалась равной 450 нм и 60 нм, а ширина — 200 нм и 60 нм. На рисунках 1 (c) и 1 (d) показано изображение, используемое для анализа, а в таблице 1 приведены средние значения больших и малых осей золотых наноостровов, соотношения сторон, расстояния между островами и рассчитанная поверхностная плотность.

Длина 198,89 нм Ширина 146.67 нанометров / μ м 2

Таблица 1 показывает, что наноостровки довольно большие, далеко друг от друга, и их поверхностная плотность невысока.Также было рассчитано распределение золотых наноостровов по размерам. Эти расчеты были основаны на изображении SEM с меньшим увеличением, показанном на рис. S1A. Для расчета распределения размеров островков рассматривается площадь 12,7 мкм, м x 9,52, мкм, м, как показано в прямоугольнике на рисунке S1B. Гистограмма на рис. S1C четко показывает широкое распределение по размерам (от 20 нм до примерно 350 нм в диаметре), причем все размеры имеют почти равный вклад. Распределение наноостровков по размерам можно улучшить путем отжига осажденных наночастиц при той же температуре (560 ° C), но в течение гораздо более длительного времени (10 ч).Изображение SEM и соответствующая гистограмма показаны на рис. S1 (D и F).

Как видно из гистограммы, размеры большинства островков сосредоточены в диапазоне от 20 до 80 нм. Несмотря на лучшее распределение, мы выбрали более короткое время отжига, поскольку размер наноостровков в этих условиях больше. Принимая во внимание сложный протокол многоступенчатого зондирования, наличие больших наноостровков с большой глубиной проникновения плазмонного поля было бы более подходящим и выгодным для более высокой чувствительности в случае экзосом, которые обычно имеют большой размер.

2.3. Физическое моделирование

В этом разделе мы построили модель, основанную на количественном анализе наноостровов, показанном в предыдущем разделе. Принимая во внимание средний размер и поверхностную плотность наноостровков, найденные по данным СЭМ, мы вычислили количество различных сущностей, участвующих в процессе био-зондирования, которые могут быть иммобилизованы на поверхности наноостровков. При иммобилизации последовательных слоев на поверхности наноострова мы считали их размерные размеры известными из литературы [37, 38].Типичный золотой наноостров имеет форму эллипсоида, как показано на рис. S2A, со средними размерами 200 нм (L), 150 нм (W) и 50 нм (T), полученными в результате анализа частиц. Максимальная площадь, доступная для иммобилизации на этих эллипсоидных наноостровках, составляет приблизительно

. Площадь поверхности наноостровков ограничивает количество различных лигандов, которые могут быть иммобилизованы на его поверхности. Площадь поверхности, рассчитанная с использованием (1), была использована для дальнейших оценок. Рис. S2B показывает, что, несмотря на больший размер биологических объектов, участвующих в процессе зондирования, распадающееся плазмонное поле большого наноострова достигает экзосом, которые являются целью процесса обнаружения.На рис. S2C показано поперечное сечение одного наноострова, несущего последовательные слои соединений, участвующих в обнаружении экзосом. Как показано на модели (фиг. S2C), лиганды состоят из линкера и стрептавидина, связанного с биотином-Vn96. Предполагается, что форма комплекса линкер-стрептавидин-биотин представляет собой прямоугольное тело с размерами 4,2 нм x 4,2 нм x 9 нм [37, 38]. Следующий слой состоит из Vn96, полипептида, специально разработанного для захвата экзосом, имеющего предсказуемую сферическую форму с диаметром 2 нм, а экзосомы моделируются в виде сфер диаметром 100 нм.Принимая во внимание доступную площадь поверхности, количество Vn96 и экзосом, которые могут быть размещены на одном наноострове, было оценено на основе их физических размеров и ограничений и показано в таблице 2.

Стрептавидин Биотин-ПЭГ-Vn96 Экзосомы Площадь поверхности наноострова 9014 9014 (A1)лигандов Площадь поверхности для Vn96 (A3) Кол-во Vn96 Площадь экзосом (A4) Кол-во экзосом 3,486 x10 4 нм 2 9016 9016 1976 4,49 x10 4 нм 2 12810 1,16 x10 5 нм 2 916 Из таблицы 2 видно, что каждый наноостров может вместить максимум 1976 лигандов стрептавидина, 12810 молекул Vn96 и только 9 экзосом.В наших экспериментах каждая молекула Vn96 связана с биотином через линкер PEG; следовательно, количество Vn96, которое может вместить наноостров, равно количеству комплексов биотина, то есть 12810 на каждом наноострове. Поскольку стрептавидин может связываться с 4 молекулами биотина, тогда как только 7904 молекулы биотин-PEG-Vn96 могут быть связаны с максимально доступным стрептавидином, а остальные молекулы будут смыты. Теоретически каждая молекула Vn96 может закрепляться на экзосоме, связываясь с одним белком теплового шока, содержащимся на поверхности экзосом.Из физического моделирования ясно, что количество молекул Vn96, доступных для захвата экзосом, намного больше, чем количество экзосом, которые может вместить каждый наноостров. Рассматривается гексагональная ориентация экзосом, чтобы понять, сколько молекул Vn96 действительно может способствовать захвату экзосом. Процент молекул Vn96, участвующих в связывании экзосом, очень низок, всего около 5%. На рис. S2 (D и E) показана ориентация экзосом, на рис. S2D показан вид сверху, а на рис.S2E, изометрическое изображение экзосом, захваченных молекулами Vn96. Молекулы Vn96, которые действительно способствуют захвату экзосом, показаны оранжевым, как показано на рис. S2 (D и E). Протокол биосенсинга, разработанный для обнаружения экзосом, состоит из иммобилизации различных соединений на золотых наноостровках путем связывания или адсорбции слоев различной толщины. Для используемого здесь подхода важно оптимизировать два этапа: связывание стрептавидина с биотином и захват экзосом, в то время как используемые здесь концентрации Nanothink и EDC-NHS аналогичны тем, которые используются для биочувствительности других биомолекул [39] .С этой целью варьировали концентрацию и количество субъектов, участвующих в протоколе биосенсинга, чтобы максимизировать сдвиг полосы плазмона Au на каждом из важных этапов. Поскольку основным шагом в определении результата процесса восприятия является взаимодействие Vn96 с экзосомой, казалось разумным оптимизировать образование комплекса стрептавидин и биотин, в конкретном случае биотина, связанного с Vn96, через фрагмент PEG. Из-за высокого сродства и стабильности модельная система стрептавидин-биотин, ее структура и механизм образования были тщательно исследованы [40–42].Это не относится к комплексу биотин-ПЭГ-Vn96, который был синтезирован совсем недавно с единственной целью связывания экзосом. Сначала изменяли только концентрацию раствора стрептавидина, чтобы найти концентрацию, которая приведет к максимальному смещению полосы Au LSPR. Зависимость ∆ λ от концентрации стрептавидина показана на рисунке 2 (а). Наибольший сдвиг (4,5 нм) наблюдается, когда концентрация стрептавидина составляет около 0,04 нМ. Из экспериментальных результатов было замечено, что при более низких концентрациях стрептавидина значения сдвига LSPR нестабильны по сравнению со значениями, соответствующими более высоким концентрациям.Поэтому вместо рассмотрения концентраций с самым высоким сдвигом LSPR, концентрация с более стабильным сдвигом LSPR рассматривается для дальнейшей оптимизации протокола биодатчика. Рассматривается концентрация стрептавидина 0,19 нМ, а концентрация биотин-ПЭГ-Vn96 варьируется для изучения влияния соотношения биотин-ПЭГ-Vn96 к стрептавидину. На рисунке 2 (b) показана зависимость среднего сдвига LSPR при использовании различных соотношений биотин-PEG-Vn96 и стрептавидина, при сохранении постоянной концентрации стрептавидина на уровне 0.19 нМ. Хорошо известно, что одна молекула стрептавидина может связываться с четырьмя молекулами биотина и соответствующий этому соотношению сдвиг LSPR максимален [40, 43]. Следовательно, если отношение стрептавидина к биотину поддерживается около четырех, сдвиг LSPR Au должен быть самым большим. Из рисунка 2 (b) видно, что, как и ожидалось, максимальный сдвиг достигается, когда отношение биотина к стрептавидину поддерживается около четырех. Это соответствует 5,23 × 10 14 комплексов биотин-ПЭГ-Vn96, содержащих 1.14 x10 14 молекул стрептавидина. Далее, сдвиг LSPR уменьшается с увеличением отношения комплекса. Результаты показали, что при работе с более низкими концентрациями биотин-ПЭГ-Vn96 до стрептавидина значения сдвига LSPR показывают плохую воспроизводимость. Это может быть связано с менее доступными молекулами биотин-ПЭГ-Vn96 по сравнению с молекулами, которые могут быть размещены молекулами стрептавидина, и в этой ситуации связывание является случайным. Сравнивая это число с рассчитанным теоретически, можно видеть, что в условиях эксперимента образовывалось значительно большее количество комплексов.Однако, если мы рассмотрим удаление несвязанных комплексов в процессе промывки, количество молекул из экспериментальных результатов совпадает с результатами физического моделирования, подтверждая модель. Результаты показывают, что поверхностная плотность наноостровков, созданных методом тепловой конвекции, достаточно высока для размещения молекул комплекса биотин-ПЭГ-Vn96, участвующих в эксперименте. Оптимизированные концентрации всех сущностей, используемых в протоколе биосенсинга, и соответствующие сдвиги LSPR приведены в таблице S1.Количество (объем) каждого объекта в протоколе биочувствительности выбирается таким образом, чтобы охватить всю зону восприятия. Кривая зависимости, показывающая сдвиг полосы Au LSPR для различных концентраций экзосом, а именно, соответствующих факторам разведения 50x, 25x, 10x, 5x, 1x, показана на рисунке 2 (c). На рис. 2 (d) представлено распределение по размерам и количество экзосом, соответствующих различным разведениям экзосом MCF7, количественно определенное с помощью прибора Tunable Resistive Pulse Sensing (TRPS) (qNano от iZON science).Кривая зависимости (рис. 2 (c)) построена с использованием концентрации экзосом MCF-7, содержащей 1,33 × 10 10 частиц / мл. Из этого графика видно, что средний сдвиг увеличивается по мере уменьшения коэффициента разбавления и достигает максимального сдвига для неразбавленного образца. Следует отметить, что уравнение кривой отражает нелинейный тренд в виде где x соответствует количеству взаимодействий экзосомы-Vn96. Из экспериментальных результатов можно наблюдать, что сдвиг LSPR имеет нелинейную зависимость от связывания с Vn96 и что кривая не является насыщенной, что ясно показывает, что емкость платформы наноостровов все еще достаточно высока для захвата большего количества экзосом, чем фактический количество экзосом в культуральной среде, использованной в этом эксперименте. Для целей моделирования экзосомы считались сферическими и имели одинаковый размер (100 нм), но на самом деле их размер варьируется от 30 до 100 нм, а форма может быть не совсем сферической, как показано на рисунке 2 (e). Экзосома, захваченная золотым наноостровом, показана на рисунке 2 (f), тогда как на рисунке 2 (g) показан кластер экзосом, захваченный более крупным золотым островком, как показано при моделировании. Это хорошо видно на рис. S3 (A и B). Количество доступных HSP на поверхности экзосом варьируется в зависимости от размера экзосом и стадии заболевания.Когда экзосомы захватываются Vn96, взаимодействия могут приводить к деформации из-за их упругой природы. Следовательно, связывание HSP с молекулами Vn96 (связывание белок-белок) приведет к нелинейному поведению. Кривая зависимости позволяет оценить концентрацию с точки зрения количества экзосом в образце. Анализ частиц показал, что плотность наноостровков составляет около 3 наноостровов / мкм м 2 . Как установлено моделированием, каждая из них может вместить 9 экзосом, то есть всего 27 экзосом на площади 1 мкм м 2 разработанной платформы.Предыдущее исследование показало, что среднее количество экзосом, которые могут быть захвачены из плазмы пациента с глиобластомой на двумерной планировочной поверхности чипа с привитыми моноклональными антителами к CD63, составляет 9 микровезикул / мкм м 2 [15], тогда как наша платформа способна вместить гораздо большее количество экзосом. Поскольку образец, используемый в этой работе, соответствует культуре клеток линии клеток рака молочной железы, концентрация экзосом в неразбавленном образце может быть отнесена к раку, как показано на рисунке 3 (c), где общее количество экзосом в единице объема плазмы заметно больше, чем в нормальной плазме [15].В качестве альтернативы, концентрация экзосом, соответствующая 50-кратному разведению, будет означать доброкачественную ситуацию или очень раннюю стадию заболевания. Следовательно, протестированный диапазон концентраций охватывает широкий диапазон, начиная с концентраций экзосом, присутствующих в данной жидкости организма, имитируя доброкачественную раннюю стадию заболевания, до полностью развившегося ракового состояния. Таким образом, можно сделать вывод, что платформа наноостровов, разработанная в этой работе на основе LSPR, может эффективно обнаруживать рак от ранней до поздней стадии. СЭМ и АСМ изображения экзосом из клеток рака молочной железы (MCF7) показаны на рисунках 3 (a) и 3 (b) соответственно. Взаимосвязь между сдвигом LSPR и концентрацией экзосом во время прогрессирования рака схематически показана на рисунке 3 (c). Известно, что концентрация экзосом, присутствующих в жидкостях организма, значительно (во много раз) увеличивается у онкологического пациента по сравнению со здоровым пациентом. Например, в случае упомянутого выше исследования плазмы пациента с глиобластомой [15] было обнаружено, что концентрация экзосом примерно в 50 раз выше, чем у здорового пациента.Следовательно, мы могли бы предположить, что концентрация экзосом, обнаруженная путем измерения плазмонного сдвига LSPR, будет отражать прогрессирование рака, как показано на рисунке 3 (c). 3. Заключение В этой работе был оптимизирован протокол обнаружения внеклеточных везикул с помощью LSPR, основанный на их высоком сродстве к полипептиду Vn96. Простая физическая модель была разработана путем анализа характеристик золотых наноостровов, расчета их площади поверхности и количества различных видов, которые могут быть последовательно иммобилизованы на поверхности наноостровов.Подсчитано, что наиболее важным этапом протокола, определяющим результат всего процесса зондирования, является образование комплекса стрептавидин-биотин-PEG-Vn96. Поэтому концентрации стрептавидина и комплекса биотин-ПЭГ-Vn96 были оптимизированы экспериментально, и максимальный сдвиг LSPR был обнаружен для отношения 1 к 4 в соответствии с физическим моделированием. Анализ частиц, выполненный на изображениях SEM, показал, что плотность наноостровков составляет около 3 наноостровков / мкм м 2 .Путем моделирования было обнаружено, что каждый из наноостровков может вмещать 9 экзосом, то есть всего 27 экзосом на мкм м 2 . На практике это означает, что разработанная платформа Au наноостровов может улавливать гораздо большее количество внеклеточных везикул, чем то, которое присутствует в образце MCF7, использованном для этого исследования, обеспечивая очень широкий диапазон обнаружения, охватывающий от ранних до продвинутых стадий. Основываясь на наших предварительных результатах, новый метод обнаружения внеклеточных везикул LSPR может быть использован в качестве инструмента для диагностики рака на ранней стадии заболевания. 4. Материалы и методы 4.1. Материалы Подложки, используемые в этом эксперименте, представляют собой предметные стекла микроскопа, приобретенные у Technologist Choice, Bio Nuclear Diagnostics Inc., с температурой стеклования = 820 ° C. Подложки разрезаются до размеров 37 мм x 12,5 мм x 1 мм. Тригидрат хлорида золота (III) (HAuCl 4 .3H 2 O) и цитрат натрия были приобретены у Sigma Aldrich. Деионизированная (DI) вода с удельным сопротивлением 18 МОм, используемая во всех экспериментах, была получена из системы чистой сверхчистой воды NANO (Barnstead).11-меркаптоундекановая кислота в этаноле (Nano Thinks Acid 11), N- (3-диметиламинопропил) -N’-этилкарбодиимид гидрохлорид (EDC) и N-гидроксисукцинимид (NHS) и фосфатно-солевой буфер (PBS) были получены от Sigma Aldrich. , Канада. Таблетки PBS растворяли в деионизированной воде при концентрации 0,1 М (pH = 7,2). Стрептавидин был приобретен у IBA GmBH. Биотин-ПЭГ-Vn96 был приобретен у New England Peptide. Экзосомы MCF7 очищали из среды, кондиционированной клетками MCF7, в биореакторе, используя ультрацентрифугирование, и ресуспендировали в среде для культивирования клеток, не содержащей сыворотки плода быка, и определяли концентрацию экзосом с помощью NTA [24]. 4.2. Изготовление платформы золотых наноостровов Трехмерные (3D) структуры золотых (Au) наноостровов на стеклянных подложках были изготовлены из коллоидного раствора золота, который впоследствии был нанесен на стеклянные подложки методом тепловой конвекции. Коллоидный раствор золота получали восстановлением тригидрата хлорида золота (III) (HAuCl 4 .3H 2 O) (золотохлористоводородная кислота) цитратом натрия по методу Туркевича [44]. Вкратце, 15 мг HAuCl 4 .3H 2 O растворяли в 90 мл деионизированной воды и нагревали до тех пор, пока раствор не достиг точки кипения. Затем к кипящему раствору добавляют 5 мл 2% раствора цитрата натрия. После добавления цитрата натрия можно отчетливо наблюдать изменение цвета от первоначального желтого до прозрачно-пурпурного (винно-красный), что свидетельствует о наличии наночастиц золота. Тем временем стеклянные подложки очищали мыльным раствором и деионизированной водой, затем промывали ацетоном, 2-пропанолом (IPA) и сушили.Далее подложки нагревали при 100 ° C в печи в течение 1 часа для удаления влаги и возможных загрязнений. Стеклянные подложки погружали в химический стакан, содержащий коллоидный раствор золота, под углом примерно 30 0 и выдерживали при температуре от 50 до 55 ° C. Наночастицы Au из коллоидной суспензии будут медленно испаряться и осаждать многослойные частицы Au на подложке, как показано на рис. S4 (A и B). Наноостровки золота были изготовлены путем отжига образцов при 560 ° C в течение 1 часа 10 часов. 4.3. Протокол биосенсинга Различные этапы протокола биосенсинга и соответствующие им сдвиги LSPR показаны на рис. S5 (A и B). Первый шаг состоит из функционализации наночастиц Au путем погружения образца в раствор 11-меркаптоундекановой кислоты (Nanothink) (5 мМ) на 3 часа и последующего высыхания. После этого шага спектр поглощения измеряется с помощью спектрофотометра Perkin Elmer (Lambda650). Сдвиг полосы плазмона Au в сторону более длинных волн подтверждает наличие самоорганизованного монослоя линкерных молекул на поверхности наноостровков.На следующем этапе монослой, образованный на поверхности наноостровков Au, активируется путем добавления 200 мкл л сшивающего агента, который представляет собой смесь (1: 1) 0,1 М N- (3-диметиламинопропил) -N ′ -этилкарбодиимида гидрохлорид (EDC) и 0,05 М N-гидроксисукцинимид (NHS), а затем инкубировали в течение 2 часов. После высыхания спектр снова измеряется. Следующим шагом является иммобилизация стрептавидина на активированном линкерном слое. 200 мкл л 0,19 нМ раствора стрептавидина в воде добавляют к активированному линкерному слою, инкубируют в течение часа и оставляют сушиться перед проведением спектрального измерения.На следующем этапе 200 мкл л 0,87 нМ раствора биотин-ПЭГ-Vn96 наносят поверх слоя стрептавидина, инкубируют в течение 4 часов, сушат и снова проводят спектральное измерение. Заключительный этап протокола биосенсинга включает осаждение 200 мкл л кондиционированной среды для культуры клеток MCF 7 (линия клеток рака молочной железы), содержащей ЭВ / экзосомы для их относительной иммобилизации. Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении публикации этой статьи. Вклад авторов S.B. (Симона Бадилеску), М. Пакирисами и А. Гош задумали исследование и эксперименты. С. (Шринивас Батини), Д. Раджу и А. Кумар проводили эксперименты и внесли свой вклад в рукопись. Р. Дж. Уэллетт предоставил материалы. Все авторы рецензировали рукопись. Выражение признательности Авторы выражают признательность М. Пакирисами за поддержку со стороны Совета по естественным и инженерным исследованиям Канады (NSERC), председателя исследовательского центра Concordia и Фонда инноваций Нью-Брансуика (NBIF). Дополнительные материалы Рис.S1: Распределение размеров золотых наноостровков при двух разных временах отжига. (A) СЭМ-изображение большой площади золотых наноостровков после 1-часового отжига; (B) бинарное изображение 1-часовых отожженных золотых наноостровков; (C) гистограмма, соответствующая распределению по размерам наноостровков золота после отжига в течение 1 часа; (D) СЭМ-изображение золотых наноостровков после 10 часов отжига; (E) бинарное изображение 10-часового отожженного золотого наноостровка; (F) гистограмма, соответствующая распределению по размерам наноостровков золота, отожженных в течение 10 часов. Рис.S2: Физическое моделирование взаимодействий. (A) Золотой наноостров в форме полуэллипсоида (B), распад плазмонного поля большого наноострова. (C) Поперечное сечение одного наноострова, иммобилизованного последовательными слоями биоэлементов, участвующих в обнаружении экзосом. Экзосомы, захваченные молекулами Vn96 ((D) вид сверху и (E) изометрический вид). Сферы розового и синего цвета представляют экзосомы и молекулы Vn96 соответственно. Рис.S3: СЭМ-изображение золотых наноостровов с экзосомами и без них. (A) СЭМ-изображение золотых наноостровков без экзосом. (B) СЭМ-изображение золотых наноостровков с экзосомами. Рис.S4: Изготовление платформ золотых наноостровов. (A) Схема процесса конвективной сборки. (B) Схема морфологической настройки золотых многослойных слоев на островки золота путем отжига. Рис. S5: Протокол биодатчика и соответствующие им полосы поглощения. (A) Схема протокола биодатчика. (B) Полоса плазмонов наноостровов Au, соответствующая различным этапам протокола. Таблица S1: Концентрации и объем сущностей, используемых в протоколе биосенсинга, с их соответствующим средним сдвигом LSPR . (Дополнительные материалы) IJMS | Бесплатный полнотекстовый | Исследование взаимодействий между AuNP / AgNP и гигантскими однослойными пузырьками (GUV) с использованием гиперспектральной микроскопии темного поля 1. Введение Благородные металлические наночастицы (NP), такие как наночастицы золота и серебра (AuNP и AgNP), представляют собой кластеры от десятков до тысяч золота или атомы серебра размером от 1 до 100 нм.Они все больше интегрируются в широкий спектр биомедицинских приложений благодаря своим уникальным оптоэлектронным характеристикам и химическому составу поверхности, а также возможности хорошо контролируемого синтеза. Будучи биосовместимыми и инертными [1,2], AuNP очень привлекательны для биомедицинских и фармацевтических приложений [3,4], таких как доставка лекарств и генов [5], медицинская диагностика [6,7] и терапия [8,9] . С другой стороны, наночастицы серебра (AgNP) давно известны своим мощным антимикробным и противовоспалительным действием для таких применений, как перевязка ран и биомедицинские имплантаты [10].Было показано, что как золотые, так и серебряные НЧ проявляют противоопухолевый эффект за счет ингибирования врожденной функции гепарин-связывающих факторов роста, тем самым подавляя аномальный рост кровеносных сосудов [11]. Многочисленные исследования на животных показали, что НЧ золота или серебра могут значительно уменьшить размер опухоли и повысить выживаемость животных как при фототермической, так и при лучевой терапии [11]. Учитывая перспективность использования НЧ золота или серебра в целенаправленном уничтожении раковых клеток при сохранении нормальной ткани [11,12,13], необходимы дополнительные исследования на молекулярном уровне для разработки более безопасных, надежных, эффективных и действенных НЧ золота и серебра. на основе терапевтических систем.С другой стороны, клеточные мембраны являются критическими местами для специфического нацеливания на раковые клетки, но фундаментальные механизмы, которые управляют взаимодействиями НЧ золота или серебра и клеточных мембран, остаются в основном неубедительными. Неизбежная адсорбция наноматериалов на поверхности мембран изменяет физико-химические свойства мембраны [14]. Следовательно, крайне важно проводить исследования на основе упрощенных модельных систем для выявления физико-химических факторов взаимодействия, происходящего между наночастицами и биологическими мембранами.Гигантские однослойные везикулы (GUV) представляют собой модельную мембранную систему, используемую в этом исследовании, поскольку они обеспечивают ограниченный объем размером с клетку для изучения биохимических реакций, а также процессов самосборки, которые позволяют настраивать липидный состав. Размер GUV колеблется от 1 до 100 мкм, что позволяет легко различить их с помощью световой и флуоресцентной микроскопии. Самый простой GUV состоит из сферического липидного бислоя, содержащего буфер. Этот связанный с мембраной объект имитирует три важных свойства клетки, а именно: компартментализацию, конечную площадь поверхности и эластичность клеточных мембран при изгибе.GUV позволяют проводить оптические исследования на уровне отдельных везикул, таким образом предлагая простую модельную систему для изучения фундаментальной термодинамики мембраны, мембранных доменов и механических свойств, таких как кривизна мембраны, морфология мембраны и изменения формы [15]. Поскольку фосфатидилхолин является наиболее распространенным липидом в мембранах эукариотических клеток, в качестве основного состава GUV, используемых в этом исследовании, был выбран димиристоилфосфатидилхолин (DMPC). DMPC представляет собой широко используемую цвиттерионную фосфолипидную молекулу в модельных мембранах с 14 атомами углерода в алкильной цепи и температурой плавления 24 ° C.Состав липидных мембран является важным фактором, влияющим на взаимодействие НЧ с мембраной. Холестерин (ХОЛ) является доминирующим стериновым компонентом клеточных мембран млекопитающих, который регулирует их текучесть. Холестерин ведет себя как спейсерная молекула или динамический «клей», который заполняет сфинголипиды и фосфолипиды, что позволяет плотной упаковке образовывать микродомены плавающей мембраны, известные как липидные рафты [16,17]. Липидные рафты представляют собой динамические жидкостные упорядоченные платформы, которые могут включать или исключать белки в различной степени [18], обеспечивая таким образом якорь для рецепторов, факторов связывания, эффекторных ферментов и субстратов для согласованной функции передачи сигналов клетки [17].Модуляция злокачественного фенотипа раковых клеток с точки зрения адгезии раковых клеток, агрессивной инвазии и метастатического распространения происходит на поверхности в значительной степени за счет липидных рафтов [19]. Например, CD44 представляет собой молекулу-маркер, экспрессирующуюся в раковых клетках и ассоциированную с адгезией, миграцией и метастазированием раковых клеток. Его изобилие в липидных рафтах было отмечено в нескольких отчетах [20,21,22]. Было показано, что лечение истощения холестерина запускает выделение CD44 и, следовательно, подавляет миграцию опухолевых клеток [23].Учитывая важную роль холестерина в регулировании текучести клеточных мембран, следовательно, способность удерживать ключевые белки в терапии рака, мы протестировали GUV при различных молярных концентрациях DMPC: CHOL, чтобы понять влияние холестерина на взаимодействия GUV-NP. Основным методом наблюдения, используемым в этой работе, является микроскопия темного поля (DFM), которая работает за счет специальной оптической конструкции, которая позволяет только свету, рассеянному от неокрашенного образца, собираться линзой объектива, отклоняя при этом освещение.В результате на темном, почти черном фоне появляется ярко освещенное изображение со значительно улучшенным соотношением сигнал / шум. Темнопольная микроскопия — это эффективный оптический метод наблюдения наночастиц размером от нескольких до десятков нанометров в естественных условиях [24], поскольку крошечный размер наночастиц намного превышает предел разрешения около 200 нм для обычных световых микроскопов. Другое отличительное преимущество DFM, особенно в отличие от флуоресцентной микроскопии, заключается в том, что он позволяет наблюдать биологические молекулы без конъюгации флуоресцентных меток.Отсутствие меток в DMF дает преимущество при исследовании биологических систем в естественном состоянии, что имеет большее биомедицинское значение по сравнению с теми, которые конъюгированы с флуоресцентными метками, достаточно крупными, чтобы изменить биологическое состояние. Система полевой микроскопии (CytoViva, Inc., Оберн, Алабама, США), используемая в этой работе, представляет собой формирование гиперспектральной визуализации (HSI), метод, сочетающий спектрофотометрию и визуализацию [25]. Усовершенствованная оптика и алгоритмы, встроенные в систему, позволяют неразрушающим образом получать пространственные изображения и спектральную характеристику отражения для каждого пикселя одновременно.Вместо того, чтобы делать одну фотографию только с доминирующей длиной волны, HSI содержит полный спектральный отклик в каждом пикселе, что позволяет количественно охарактеризовать НЧ и их взаимодействия с биомолекулами. Спектры рассеяния, возникающие при взаимодействии света с веществом, охватывают последствия электрических, оптических и плазмонных свойств НЧ, а также их локального окружения. Спектральный диапазон может варьироваться от видимого ближнего инфракрасного (VNIR) до коротковолнового инфракрасного (SWIR), в зависимости от настройки камеры CCD.Недавнее исследование показывает, что HSI может улучшить цитологическую диагностику раковых клеток [26]. В этой статье мы сообщаем о наших основных результатах, полученных с помощью гиперспектральной микроскопии в темном поле, о взаимодействиях между цитрат-стабилизированными коллоидными AuNP или AgNP и GUV различного состава, включая чистый DMPC до различных процентных молярных концентраций CHOL: DMPC (10, 20, 30 и 40 мол.%). Размер, выбранный как для AuNP, так и для AgNP, составлял 10 нм, потому что в нашей более ранней работе было обнаружено, что AuNP 10 нм наиболее способны вызывать изменения фазы и формы липидных везикул [27].Результаты, представленные в этой работе, предназначены для лучшего понимания механизмов AuNP / AgNP и мембранных взаимодействий, которые являются фундаментальными и важными для их будущего применения как в терапии, так и в диагностике рака. 3. Обсуждение Четкая спектральная форма и длина волны пика, как видно из спектральных профилей от AuNPs по сравнению с AgNPs (рисунок 1b против рисунка 2b), демонстрируют, что гиперспектральная функция DFM способна охарактеризовать NP в отношении их типов, форм и размеры.Спектральные профили в результате рассеяния и отражения от плазмонных НЧ чувствительны к диэлектрической среде в окружающей среде, поэтому их можно дополнительно охарактеризовать при адсорбции на липидных мембранах, чтобы понять взаимодействия. Красные сдвиги на 25 нм и 31 нм наблюдаются для AuNP и AgNP соответственно при взаимодействии с GUV (рис. 5). Ранее для AuNP наблюдались большие красные сдвиги, что объяснялось образованием кластеров NP [28]. Сдвиги в оптических спектрах AgNP также ожидаются из-за изменений окружающей диэлектрической среды при адсорбции, но часто такие сдвиги намного меньше (~ 5-10 нм) [29].Поверхностные плазмоны — это колебания плотности заряда, ограниченные поверхностью металлической НЧ. Когда НЧ образуют кластер, плазмоны подвергаются гибридизации из-за межчастичных взаимодействий [30]. Когда межчастичное расстояние между двумя НЧ находится в пределах диапазона кулоновского взаимодействия, осцилляции плотности заряда двух отдельных НЧ гибридизуются, образуя перенормированные энергии плазмонов. Мы связываем красные сдвиги AuNPs и AgNPs при взаимодействии с GUVs сопряженным эффектом агрегации NP и поверхностного прикрепления липидных молекул.Результаты визуализации DFM показывают морфологическое различие между GUV + AuNP и GUV + AgNP (рисунок 6 и рисунок 7). AuNPs имеют тенденцию образовывать непрерывную золотисто-коричневую корку на поверхности мембраны, тогда как AgNPs украшены драгоценными камнями на мембране в виде отдельных частиц или кластеров. Это различие НЧ в прикреплении к мембране или интеграции, наблюдаемое при пространственной визуализации, также отражается в значительной разнице между спектральной шириной линии от GUV + AuNP и GUV + AgNP. Мы узнали из спектрального анализа всех образцов на рисунке 5, что AuNP имеют тенденцию уменьшать FWHM GUV, тогда как AgNP имеют тенденцию увеличивать FWHM GUV.В целом, GUV + AgNP имеют гораздо большие ошибки, чем GUV + AuNP как для пиковых длин волн, так и для FWHM. Среди многих причин оптического уширения спектра мы обнаруживаем, что неоднородное уширение является наиболее вероятной причиной уширения GUV + AgNP. Морфологическое наблюдение действительно подтверждает, что GUV + AgNPs принимают намного различные конфигурации, чем GUV + AuNPs. Поверхность, границы зерен и вариации стехиометрии более выражены в GUV + AgNP, чем в GUV + AuNP. Следовательно, излучающие частицы в GUV + AgNP в очень разнообразных локальных средах будут излучать с сильно отличающимися частотами, чем частицы из GUV + AuNP, вызывая уширение.С другой стороны, из-за однородности взаимодействий GUV-AuNP спектральные ширины линий даже меньше, чем у только GUV. Основываясь на различиях в морфологии и спектральных ответах между GUV + AuNPs и GUV + AgNPs, мы предполагаем, что существует различие в механизме взаимодействий между AuNPs / AgNPs и GUVs. AuNPs, скорее всего, интегрированы в липидный бислой. Если бы AuNPs просто адсорбировались на липидном бислое (или совместно локализовались физически), результирующий спектральный профиль должен был бы перекрываться с профилями AuNPs и GUVs отдельно.Поскольку средние пики GUV или AuNP только составляли ~ 580 нм и ~ 590 нм соответственно, ожидаемый спектральный пик перекрытия должен быть между 580 и 590 нм. Однако средний спектральный пик GUV + AuNP составляет ~ 615 нм, что длиннее, чем у любого из них по отдельности. Вероятно, это может быть результатом ослабленного поверхностного плазмонного эффекта на AuNPs, когда они оказываются в ловушке между липидным бислоем. Когда дело доходит до AgNP, они в основном адсорбируются на липидном бислое в виде отдельных NP или кластеров NP. Спектральные пики GUV + AuNP имеют большие вариации, смещаясь от 540 нм до 635 нм по сравнению с ~ 550 нм для одного AgNP.Взаимодействия между AgNP и GUV более разнообразны, чем между AuNP и GUV. Интеграция и адсорбция одинаково вероятны для взаимодействия AgNP-GUV, тогда как интеграция более распространена для взаимодействия AuNP-GUV. Присоединение AuNPs и AgNPs к GUV-поверхностям — неизбежный первый шаг между взаимодействием NP-мембраны из-за электростатической силы между отрицательно заряженным цитратным слоем вокруг NP (рис. 8a) и катионными амино- и анионными фосфатными группами во внешнем слое. ГУВ (рис. 8б, в).Электростатические взаимодействия важны не только для адгезии НЧ, но и критичны для разрушения мембран [31]. Несмотря на то, что Au и Ag находятся в одной группе в периодической таблице, Au имеет более высокий эффективный ядерный заряд по сравнению с Ag. По этой причине цитрат-анионы в сольватационной сфере частиц должны более прочно связываться с AuNP, чем с AgNP. Таким образом, мы предполагаем, что способность катионов разрушать внешний слой липидных мембран проявляется в гораздо большей степени для AuNP, чем для AgNP.Многочисленные экспериментальные и имитационные исследования сообщили о разрушении липидных бислоев с помощью AuNPs [27,31,32,33,34]. Между тем, когда AuNPs разрушают внешний листок липидного бислоя, цитрат-анионы, вероятно, удаляются и остаются в водном растворе, поскольку гидрофобная сила между ацильными цепями DMPC и AuNPs перевешивает силу сольватации. Мы предполагаем, что AuNPs, захваченные в гидрофобном бислое, пытаются избавиться от его избытка поверхностной энергии, рекрутируя больше AuNPs из раствора (первоначально при поддержке разрушающей электростатической силы) и вызывая рост корки в бислое [32].Как только AuNPs интегрированы в липидный бислой, гидрофобное взаимодействие между AuNPs и липидными цепями, а также Ван-дер-Ваальс (VDW) между AuNPs поддерживают стабильность и равновесие формации. Для AgNP не наблюдалось образования корки, потому что они не являются достаточно разрушительными, чтобы инициировать захват в бислое. Было обнаружено, что ГУФ состава при 20 мол.% CHOL: DMPC проявляют отличные спектральные свойства по сравнению с другими. Эта концентрация совпадает с тем фактом, что типичная ядросодержащая клетка млекопитающих содержит от 10% до 20% холестерина от общего количества липидов [35].Холестерин играет важную роль, когда дело доходит до контроля размера и доли площади доменов липидной фазы в мембранах. В отсутствие холестерина фосфолипидные бислои существуют либо в высокоупорядоченной гелевой фазе, либо в жидко-неупорядоченной (l d ) фазе в зависимости от температуры. Когда присутствует холестерин, образуется промежуточная фаза, называемая жидкоупорядоченной (l o ). Жидкостно-упорядоченные липидные домены обеспечивают якорные платформы для мембранных белков, чтобы формировать липидные рафты, которые представляют собой плавающие микродомены на клеточной мембране для доставки белков и передачи клеточного сигнала [17].В предыдущих фазовых исследованиях липидной смеси с использованием восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) было обнаружено, что пороговая концентрация перколяции холестерина в липидной смеси составляет 20-25 мол.% [36]. Порог перколяции — это точка, в которой рафты соединяются, а жидкие домены разъединяются, когда 45–50% всей мембраны превращается в фазу l o . Более 20-25 мол.% Холестерин вызывает уменьшение размера липидных рафтов [37]. Эта критическая концентрация холестерина на уровне 20 мол.% В смеси липидов хорошо совпадает в нашем спектральном анализе отражения GUV (рис. 5).При 20 мол.% CHOL: DMPC длина волны пика GUV имеет красное смещение ~ 20 нм по сравнению с другим составом, а ширина линии на ~ 25 нм шире, чем у остальных. 20 мол.% CHOL в DMPC кажется идеальной и экономичной концентрацией для GUV для достижения наилучшей целостности и наименьшей проницаемости, поскольку жидкие упорядоченные домены имеют наибольшую долю в общей площади мембраны по сравнению с другими концентрациями CHOL. Это соответствие с другими исследованиями также предполагает, что метод гиперспектрального анализа можно использовать для характеристики фазы и целостности липидных мембран. 4. Материалы и методы 4.1. Коллоидные AuNPs и AgNPs AuNPs (10 нм, 0,06 мг / мл, Sigma-Aldrich # 752584, полученный от CytoDiagnostics, Inc. Burlington, ON, Canada), использованные в этой работе, были получены восстановлением хлористоводородной кислоты (HAuCl4) и цитрата. -стабилизирован в 0,1 мМ PBS [38]. Используемые в данной работе AgNP (10 нм, 0,02 мг / мл, Sigma-Aldrich # 730785) были получены восстановлением нитрата серебра и стабилизированных цитратом в водном буфере [39]. Размер 10 нм был выбран в этом исследовании, потому что наша более ранняя работа показала, что AuNP размером 10 нм были наиболее эффективными в индукции фазовых и формальных изменений липидных везикул [27].ПЭМ-изображения AuNP и AgNP (рисунки S1a и S2), использованные в этом исследовании, а также более подробную информацию о распределении по размерам (рисунок S1b), концентрации и стабилизации цитрата (рисунок S3) можно найти в дополнительном материале. 4.2. Электроформирование GUV при различной молярной концентрации холестерина по сравнению с DMPC Электроформирование GUV — это метод лабораторной подготовки для воспроизводимого и контролируемого производства гигантских липосом [40]. Он включает приложение внешнего электрического поля к липидным пленкам, пропитанным гидратирующим растворителем, чтобы вызвать набухание и последующее образование пузырьков.В улучшенном подходе переменное (AC) вместо постоянного (DC) электрического поля применялось для внесения постоянных изменений как в направлении, так и в величине напряженности поля, таким образом, заставляя липидные молекулы самоорганизоваться в однослойную двухслойную упаковку и отрасти в сферические структуры [41]. Электроформирование GUV на переменном токе позволило провести различные исследования по настройке липидных составов, формированию доменов и механическим свойствам мембран. Аппарат Vesicle Prep Pro (Nanion Technologies, Мюнхен, Германия, рис. S4) был использован для гальванопластики GUV.Сначала готовили исходный раствор фосфолипида DMPC (1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин, Sigma-Aldrich) в хлороформе (CHCl 3 ) при 6 мг / мл. В случае GUV с различной молярной концентрацией CHOL в DMPC, исходный раствор CHOL / CHCl 3 при 10 мг / мл был смешан с исходным раствором DMPC / CHCl 3 при 10, 20, 30, 40 молярный процент (мол.%) CHOL: DMPC. Приблизительно 20 мкл исходного раствора было нанесено по каплям на проводящую сторону предметного стекла, покрытого ITO, с последующим испарением растворителя в вакууме.Смазанное уплотнительное кольцо (диаметр 28 мм) затем помещали вокруг высушенной пленки и заполняли 500 мкл сорбита (210 мМ). Второй слайд ITO проводящей стороной вниз был помещен поверх уплотнительного кольца, чтобы сэндвич с пропитанной пленкой. После этого набор предметных стекол ITO поместили в электродную камеру устройства Vesicle Prep Pro (Рисунок S5). Затем на скользящую камеру подавали переменное напряжение 5 В (размах) с частотой 5 Гц при температуре 36 ° C. После двух часов работы от переменного напряжения формируются GUV, которые собираются во флакон для будущего использования.Более подробную информацию о производстве GUV, включая изображение устройства и иллюстрацию камеры ITO, можно найти в дополнительных материалах. 4.3. Гиперспектральная микроскопия в темном поле 20 мкл GUV различного состава (только DMPC и DMPC, допированный 10, 20, 30 или 40 мол.% CHOL) инкубировали с 5 мкл AuNP или AgNP (размером 10 нм) или без них. ) за два часа до исследования под микроскопом. Для подготовки предметного стекла на предметное стекло наносили каплю 0,5 мкл инкубированной смеси штрихами и покровное стекло осторожно хлопали по образцу, чтобы минимизировать образование пузырьков.Затем предметное стекло помещали в темнопольный микроскоп (CytoViva, Inc., Auburn, AL, USA) как для пространственной, так и для гиперспектральной визуализации. Гиперспектральные изображения были собраны и проанализированы с помощью ENVI (EN Environment for Visualizing Images, Version 4.8, Harris Geospatial, Boulder, CO, USA), программного приложения, изначально разработанного для обработки и анализа геопространственных изображений. 4.4. Анализ длины волны пика и FWHM Длина волны пика и FWHM (полная ширина на половине максимума) были определены из спектральных профилей, собранных из широкого диапазона образцов, включая только AuNP, только AgNP, только GUV, GUV + AuNP и GUV + AgNP. .Тестируемые GUV имели различный состав от одного DMPC до 10, 20, 30, 40 мол.% CHOL: DMPC. Для каждого анализа образца из нескольких гиперспектральных изображений DFM было выбрано примерно 15 различных областей. В каждой интересующей области было выбрано примерно 10 точек для получения среднего спектрального профиля. Пиковая длина волны и FWHM были затем определены из экспортированных спектральных данных путем нахождения длины волны, соответствующей максимальной интенсивности, и спектральной ширины на половине максимальной интенсивности.Определение длины волны пика и FWHM было выполнено для всех 15 областей интереса для каждого образца. Затем данные максимальной длины волны и FWHM были усреднены для получения среднего значения и стандартного отклонения для каждого образца. Оптимизированное выделение внеклеточных пузырьков из различных органических источников с использованием водной двухфазной системы Культура клеток Клеточная линия HaCaT была использована в качестве источника клеток млекопитающих. Клетки HaCaT культивировали в полной ростовой среде, состоящей из модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM) с добавлением 10% (об. / Об.) Фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% (об. / Об.) Пенициллин-стрептомицин-амфотерицина (PSA). (10000 единиц / мл пенициллина, 10000 мкг, мкг / мл стрептомицина, 25 мкг / мл амфотерицина B; Invitrogen, Gibco, UK).После достижения слияния 80–90% клетки переносили в колбу Т-150 (Zelkultur Flaschen, Швейцария) при плотности 500000 клеток / колбу и поддерживали при 37 ° C и 5% CO 2 в увлажненном помещении. инкубатор. Через день после посева клеток HaCaT в колбы полную ростовую среду заменяли собирающей средой EV, которая состояла из DMEM, 10% (об. / Об.) FBS с истощенным экзосомами (Gibco) и 1% (об. / Об.) PSA. Культуральную среду собирали через день после смены среды. Конфлюентность клеток составляла от 60 до 70% во время сбора среды, и во время сбора среды не наблюдалось мертвых клеток.Перед выделением EV питательные среды хранили при -20 ° C. Культура паразитов Leishmania infantum промастигот любезно предоставлены Институтом молекулярной и клеточной биологии (IBMC) Университета Порту (Португалия). Leishmania infantum промастиготов выращивали при 25 ° C в среде RPMI 1640 Glutamax (Gibco) с добавлением 10% (об. / Об.) Обедненного экзосомами FBS (Gibco), 50 Ед / мл пенициллина, 50 мкг г / мл стрептомицина и 20 мМ натриевая соль HEPES pH 7.4 (Сигма). Через 7–10 дней культуры в стационарной фазе Паразиты размножались до тех пор, пока не дифференцировались в инфекционные метациклические промастиготы 31 . Среды для культивирования паразитов собирали в конце дифференцировки и хранили при -20 ° C перед выделением EV. Во время сбора сред не наблюдалось мертвых клеток. Приготовление изоляционного раствора ATPS Изолирующий раствор ATPS-EV получали растворением полиэтиленгликоля (PEG) (Sigma, 81310) и декстрана (DEX) из Leuconostoc spp.(Sigma, 31392) в дистиллированной воде в соотношении 7,7: 3,3 (мас. / Мас.), Как описано в таблице 3. Таблица 3 Приготовление растворов для выделения ATPS. Изоляция EV с использованием метода изоляции ATPS-EV EV были выделены с использованием модифицированного протокола, описанного Shin et al . 20 . Процедура изоляции кратко представлена ​​на рис. 6. Рис. 6 Этапы протокола изоляции EV на основе ATPS. Растения ( Punica granatum ) были получены с местного рынка, были промыты и отжаты целиком в чистом блендере.Полученный лизат пропускали через марлю для удаления более крупных загрязнений. 20 мл растительного лизата, среды для культивирования клеток, сыворотки крови или среды для культивирования паразитов затем центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут для удаления более крупных загрязнений. Затем супернатанты пропускали через фильтры 0,22 мкм мкм для удаления более мелких загрязняющих частиц и уменьшения концентрации более крупных внеклеточных везикул. Затем отфильтрованные супернатанты смешивали в объемном соотношении 1: 1 с раствором для выделения ATPS-EV и затем центрифугировали при 1000 g в течение 10 минут для разделения фаз.Дважды 80% объема было удалено из верхней, богатой ПЭГ фазы, замененной верхней фазой промывочного раствора, приготовленного путем смешивания изолирующего раствора ATPS-EV с дистиллированной водой при объемном соотношении 1: 1 и центрифугирования при 1000 g в течение 10 минут, как описано в Kim et al . 21 . Характеристика водной двухфазной системы Построение бинодальной кривой для системы PEG35 / Dextran500, расчет фазового состава и характеристика системы PEG / Dextran ATPS, использованной в этом исследовании, были выполнены путем измерения объема и плотности уравновешенные фазы, как описано ранее 22 .Плотность фаз измеряли плотномером (Anton Paar, AMA4100M) с точностью до 0,0001 г / см 3 . Объем фаз определяли путем визуального определения линии разделения фаз между фазами и извлечения нижней фазы с помощью микропипетки. Для визуализации межфазного слоя ATPS был добавлен кумасси бриллиантовый синий R-250 для окрашивания фазы PEG, и слой между фазами был визуально подтвержден. Анализ отслеживания наночастиц Количественная оценка EV и определение распределения размеров EV были выполнены с использованием Nanosight NS300 (Malvern Instruments) с лазером 488 нм.Образцы были разбавлены до рекомендованного диапазона концентраций устройства, показывающего от 20 до 200 в рамке. Захват видео производился на уровне камеры 16 с интервалами в 60 секунд. В конце каждого захвата образец вводился в проточную ячейку, чтобы промыть предыдущую часть образца. Для каждого образца было сделано пять снимков. Образцы были проанализированы с соответствующими настройками пороговых значений. Видеозахват и анализ были выполнены с использованием программного обеспечения NTA версии 3.4. Количественное определение EV с использованием BCA Концентрации EV оценивали с использованием набора Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher) в соответствии с инструкциями производителя.В качестве стандарта использовали альбумин бычьей сыворотки (BSA). Результаты измеряли с помощью планшет-ридера (BioTek Instruments, Inc., VT, США). Характеристика поверхностных антигенов EV с помощью проточной цитометрии Маркеры поверхности EV были проанализированы с помощью проточной цитометрии. 5 мкМ г ЭВ были нанесены на 5 мкл л (4% мас. / Об., 4 мк мкм) гранул альдегид / сульфатного латекса (ThermoFisher, A37304) и инкубированы в течение 15 минут на шейкере при комнатной температуре. . Затем 200 мкл л 2% BSA в растворе PBS добавляли к смеси EV-шариков на 2 часа на шейкере для предотвращения неспецифического связывания антител.Затем к раствору добавляли достаточное количество раствора глицина (Merck) для достижения концентрации 100 мМ. Образцы EV инкубировали в течение 30 минут с глицином на шейкере. После инкубации к образцам добавляли 800 мкл л холодного PBS и образцы центрифугировали при 2700 × g в течение 3 мин. Полученный осадок EV ресуспендировали в 500 мкл л PBS и аликвотировали в 5 пробирок по 100 мкл л для инкубации с различными антителами. Конъюгированные антитела к обычным маркерам EV, CD9 (Biolegend, 124808), CD63 (Biolegend 143904), CD81 (Biolegend, 349506) и HSP70 (Biolegend 648004) добавляли в разведении 1: 1000 к каждому образцу и инкубировали в течение ночи.Первичные антитела Alix (Abcam, ab186429), TSG101 (Abcam, ab209927), CALX (Abcam, ab203439) инкубировали в течение ночи, центрифугировали при 2700 × g в течение 3 минут, чтобы отмыть образцы избыточных антител, а затем ресуспендировали в 100 мк Л разведения 1: 100 Alexa Fluor 488 (Abcam, ab150077). Проточный цитометрический анализ ЭВ проводили с использованием системы проточной цитометрии Becton Dickinson (BD) FACSCalibur (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США). Вестерн-блоттинг Антитела к маркерам EV CD9 (CellSignalling, 13174, 1: 250), флотилину (CellSignalling, 18634, 1: 1000) и GM130 (CellSignalling, 12480, 1: 1000) тестировали с помощью вестерн-блоттинга, используя вторичное антитело против кролика (CellSignalling, 7074, 1: 2000).ЭВ разделяли с помощью 4–20% градиентного геля додецилсульфата натрия и полиакриламида (Biorad, 4–20% Mini-PROTEAN® TGX TM , США) и применяли электрофорез (SDS-PAGE). Белки переносили на PVDF-мембрану (Bio-Rad # 162-0177, США) с помощью быстрого блоттера Pierce G2. Мембраны блокировали 5% сухим обезжиренным молоком в течение 1 часа 30 минут при комнатной температуре. После инкубации в течение ночи с первичным антителом при 4 ° C. Мембрану визуализировали с помощью системы ChemidocTM XRS +. Программное обеспечение Image Lab 6.0,1 использовалось для количественной оценки изображений. Сканирующая электронная микроскопия Образцы EV разбавляли 1: 100 дистиллированной водой и сушили на углеродных клейких дисках для получения изображений. СЭМ-визуализацию выполняли в сканирующем электронном микроскопе FEI ESEM QUANTA 250 FEG без покрытия методом распыления. Образцы получали изображение в режиме низкого вакуума с использованием низковакуумного детектора вторичных электронов LFD (детектор большого поля) под давлением 100 Па и при ускоряющем напряжении 20 кВ. Идентификация метиловых эфиров жирных кислот (FAME) Профили жирных кислот EV, полученных из культуры клеток, сыворотки, культуры паразитов, и EV-подобных наночастиц из растительных лизатов, были определены путем выделения жирных кислот и их преобразования в метиловые эфиры жирных кислот (СЛАВА). Подготовка проб и анализ с помощью Agilent Tech GC-Midi 6890 N выполнялись в соответствии с инструкциями производителя. 1 мл Реагента 1, состоящего из 15% NaOH, 50% метанола, добавляли в каждую пробирку, содержащую образцы EV.Затем пробирки 5–10 раз встряхивали и нагревали на кипящей водяной бане в течение 5 мин. После этого пробирки снова встряхивали и возвращали в инкубацию на водяной бане на 25 мин нагревания. После завершения инкубации пробирки охлаждали на водяной бане при 4 o ° C в течение прибл. 1 минута. 2 мл Реагента 2, состоящего из 10% HCl, 45% метанола, добавляли к образцам для реакции метилирования. Пробирки 5–10 раз встряхивали, нагревали на водяной бане при 80 ° C в течение 10 мин и снова охлаждали.Затем к образцам добавляли 1,25 мл Реагента 3, состоящего из 50% гексана, 50% метилэфир-бутилового эфира для экстракции жирных кислот. После центрифугирования при 3000 об / мин в течение 10 минут образовались две фазы. Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку, а нижнюю фазу отбрасывали. В верхнюю фазу добавляли 3 мл реагента 4, состоящего из 10% NaOH, и центрифугировали при 3000 об / мин в течение 5 мин. Затем верхнюю фазу переносили во флакон для ГХ и вставку для анализа ГХ-МС. Результаты поиска жирных кислот были подтверждены вручную и путем поиска в базе данных Sherlock с использованием системы идентификации микроорганизмов (MIS) Sherlock TM . Статистический анализ Все экспериментальные данные в этом исследовании были проанализированы с помощью программного обеспечения Graphpad Prism7. Односторонний дисперсионный анализ ANOVA был использован для оценки статистической значимости различий между экспериментальными группами. Для результатов со значениями p, меньшими 0,05, которые принимаются в качестве значения альфа, разница между группами считалась значимой. Каждый эксперимент повторяли трижды. Идентификация и характеристика классов везикул типа COPIa- и COPIb, ассоциированных с растениями и водорослями Golgi Абстрактные Везикулы белка оболочки I (COPI) возникают из цистерн Гольджи и опосредуют рециклинг белков из цистерн Гольджи обратно в эндоплазматический ретикулум (ER) и транспорт резидентных белков Гольджи между цистернами. Исследования in vitro предоставили доказательства двух различных типов везикул COPI, но in vivo сайтов действия этих везикул еще предстоит установить. Мы использовали комбинацию электронной томографии и методов иммунной метки, чтобы исследовать стеки Гольджи и связанные с ними везикулы в клетках продуцирующей чешуйку водоросли Scherffelia dubia и Arabidopsis , сохраненных методами замораживания / замораживания-замещения под высоким давлением. Было выделено пять структурно различных типов везикул.В Arabidopsis белки оболочки везикул COPI и COPII, а также молекулы груза везикул (маннозидаза I и сиалилтрансфераза-желтый флуоресцентный белок) были идентифицированы с помощью мечения иммунным золотом. У обоих организмов везикулы типа COPI дополнительно характеризовались комбинацией шести структурных критериев: архитектура оболочки, толщина оболочки, структура мембраны, окрашивание груза, цистернальное происхождение и пространственное распределение. Используя этот многопараметрический структурный подход, мы можем выделить два типа везикул COPI, COPIa и COPIb.Везикулы COPIa зачаток исключительно из цистерн и занимают пространство между цисстернами и сайтами экспорта ER, тогда как пузырьки COPIb зачаток исключительно из медиальных и транс-цистерн Гольджи и ограничены пространством вокруг этих последних цистерн. Мы пришли к выводу, что рециклинг COPIa пузырьков в ER происходит только из цис-цистерн, что ретроградный транспорт резидентных белков Гольджи пузырьками COPIb ограничен медиальными и трансцистернами, и что диффузия пузырьков периГольджи ограничена. Обмен между органеллами секреторного пути эукариотических клеток, эндоплазматическим ретикулумом (ER), Гольджи, сетью транс-Гольджи (TGN) и плазматической мембраной опосредуется везикулами. Трафик по этому пути проходит по организованным и направленным маршрутам, и каждый шаг включает в себя уникальный тип пузырьков, которые берут начало в одном компартменте и нацелены на другой. Существует общее мнение, что везикулы белка оболочки (COP) II являются носителями, участвующими в антероградном транспорте ER-to-Golgi (1, 2).Напротив, все еще существует много путаницы в отношении паттернов доставки везикул COPI (3). Имеются убедительные доказательства, подтверждающие мнение о том, что везикулы COPI, происходящие из цистерн цис-Гольджи, рециркулируют мембранные молекулы обратно в ER (4). Мишени для везикул COPI, которые зарождаются из медиальных и транс-цистерн Гольджи, менее ясны, частично из-за противоречивых данных и частично из-за противоречивых гипотез о трафике Гольджи (5, 6). Модель челнока везикул постулирует, что везикулы COPI участвуют как в антероградном, так и в ретроградном транспорте между цистернами (7), тогда как модель прогрессии / созревания цистерн предполагает, что везикулы COPI используются только для ретроградного транспорта (8, 9).Степень, в которой везикулы COPI, происходящие из медиальных и транс-цистерн Гольджи, могут рециркулировать молекулы непосредственно обратно в ER, также неясна (10). Чтобы ответить на эти вопросы, мы провели сравнительный электронный томографический анализ замороженных / замороженных стопок Гольджи под высоким давлением водоросли Scherffelia dubia и высшего растения Arabidopsis thaliana и использовали эксперименты по иммуномаркированию для подтверждения идентичность везикул типа COPI и COPII и для идентификации молекул груза внутри везикул COPI. S. dubia был выбран в качестве ведущего организма по следующим причинам. Во-первых, Гольджи S. dubia , как и у других водорослей, продуцирующих протеогликаны, всегда рассматривались как прототипы Гольджи, которые перемещаются в соответствии с моделью цистернальной прогрессии / созревания (11, 12), потому что их отличительные масштабы всегда наблюдается внутри цистерн Гольджи и никогда — в пузырьках, окружающих стопки (13-15). Во-вторых, большой размер стопок (≈1.5 мкм в диаметре, 17-20 цистерн) позволяет однозначно локализовать специфические типы цистерн и везикул в дискретных доменах Гольджи.В-третьих, высокая скорость сборки и оборота цистерны (одна цистерна за 20-30 секунд) приводит к образованию большого количества транспортных пузырьков, что облегчает получение статистически значимых наборов данных (16). Двумя основными недостатками S. dubia являются отсутствие генетики и перекрестная реактивность четко определенных антител секреторного пути с белками S. dubia . Причины выбора Arabidopsis в качестве дополнительной экспериментальной системы к S.dubia были следующие. Предыдущие структурные исследования стопок Arabidopsis Golgi (17, 18) предоставили доказательства цистернального способа созревания трафика и структурного сходства между Arabidopsis и S. dubia Golgi. В частности, в клетках Arabidopsis , сохраненных замораживанием под высоким давлением / замораживанием с заменой, цис-, медиальные и транс-цистерны Гольджи можно различить на основе их положения в стопке, окрашивания их просветного содержимого и геометрия цистерн.Кроме того, были отмечены различия в типах пузырьков, ассоциированных с Гольджи, и визуализация отдельного типа оболочки на пузырьках, отрастающих от цистерн Гольджи (17, 19). Наконец, компоненты везикулярной оболочки COPI и COPII были охарактеризованы, и доступны антитела для проверки идентичности везикул и для идентификации грузов везикул (20, 21). Интересно, что исследования с помощью электронной томографии и визуализации живых клеток ER и мембран Гольджи Pichia pastoris (22, 23) показали, что многие структурные особенности, описанные для Arabidopsis Golgi, также могут наблюдаться у дрожжей, и что P.pastoris Golgi действует в соответствии с моделью цистернального созревания. Таким образом, открытие этого исследования о том, что один тип везикул COPI между Гольджи и ER, а второй тип везикул COPI вовлечен во внутри-Гольджи-трафик, может быть характерной чертой всех окруженных стенками организмов и, возможно, также может относиться к животное Гольджи. Результаты Цис-, медиальные и транс-цистерны Гольджи можно различить по морфологическим критериям. Цис-, медиальные и транс-цистерны Гольджи могут быть положительно идентифицированы с помощью морфологических критериев на тонких срезах и изображениях томографических срезов криофиксированных и замороженных растений [ Arabidopsis (Рис. 1) B ) и Nicotiana sylvestris (17)] и дрожжевых клеток P. pastoris (23). Положение одинаковых морфологических критериев в стопке, окрашивании просвета и цистернальной геометрии может быть использовано для идентификации различных цистернальных типов на изображениях томографических срезов S.dubia Golgi (рис.1 A и C ). Таким образом, окрашивание просвета первых четырех цистерн, представленных на рис. A (первые пять-шесть цистерн на срезах, где также видны первые одна или две цистерны меньшего размера) демонстрируют, что цистерны цис-типа демонстрируют гораздо более светлое окрашивание просвета и обладают более толстым просветом, чем следующие медиальные цистерны. Резкое усиление окрашивания цистернального содержимого на границе цис-медиальной цистерны совпадает с внезапным появлением темных чешуек в просвете медиальных цистерн (рис.1 A и C ). В цистернах цис-Гольджи никогда не наблюдали темных протеогликановых чешуек. У арабидопсиса цистерны цис-Гольджи всегда были очень слабо окрашены (рис. В ). Рисунок 1. Структурная дифференциация цистерн Гольджи S.dubia и Arabidopsis . Сделайте томограмму срезов стопки Гольджи S. dubia ( A ) и стопки Гольджи Arabidopsis ( B ). В A шкала протеогликана в цистернальном просвете Гольджи и другая в сократительной вакуоли (CV) отмечены стрелками. У обоих видов цис-цистерны всегда имеют слегка окрашенный и более толстый просвет. Внезапный переход к темному окрашенному содержимому просвета происходит на цис-медиальной цистернальной границе в S.дубия ( С ). Одновременно с общим усилением цистернального окрашивания начинают четко различаться характерные протеогликановые чешуйки ( C , стрелки). Отросток везикулы типа COPIa обозначен в C (COPIa). (Масштабные полосы, 100 нм.) Цистерны транс-Гольджи можно различить по их положению в стопке, свернутому центральному просветному домену и часто набухшим краям. У высших растений транс-большинство цистерн Гольджи обычно демонстрируют признаки отделения от стопок во время их трансформации в полностью независимые цистерны TGN (рис.1 B ), которые приводят к образованию покрытых клатрином секреторных пузырьков. Поскольку S. dubia секретирует образованные Гольджи чешуйки сократительной системой вакуолей на поверхность клетки (рис. A ) (24), последняя слегка окрашенная цистерна, связанная с каждым из ее стопок (рис. A ) не соответствует классическому представлению о компартменте TGN у высших растений (17) или дрожжей (23). Таким образом, строгое сравнение можно проводить только между цис-, медиальными и транс-цистернами Гольджи этих разных организмов. ER-, цис-цистерны Гольджи и медиальные / транс-цистерны Гольджи дают начало трем типам зачатков и пузырьков. Превосходная структурная сохранность различных мембранных систем в замороженных под высоким давлением клетках S. dubia и Arabidopsis вместе с высоким разрешением томографических срезов толщиной ≈2,3 нм позволили нам различить COPII и две везикулы типа COPI с помощью следующего набора структурных параметров: место происхождения везикул, архитектура оболочки, толщина оболочки, размер везикул, окрашивание груза и пространственное распределение вокруг стопок Гольджи (рис.2 и 3). Рис. 2. Галерея изображений срезов томограммы, демонстрирующих примеры пяти типов везикул, связанных с переходным ER ( A – D ), цис-цистернами ( E – H ), медиальными или трансцистернами ( I – L ), транс — самая цистерна ( M – P ) и сократительная вакуоль ( Q – T ) S.Дубия . Профили почкования пяти типов пузырьков демонстрируют отличную морфологию оболочки (увеличено во втором столбце). Покрытие типа COPII кажется тонким и относительно плотно прилегает к мембране ER ( B ). Покрытие типа COPIa кажется более толстым и рассеянным ( F ), тогда как покрытие типа COPIb кажется отдаленным от цистернальной мембраны ( J ). Покрытия на бутонизированных пузырьках на транс-самой цистерне напоминают COPII ( N ), а клатриновые оболочки на CV-системе ( R ) имеют характерную клатриновую структуру и расстояние между ними.Для каждого типа профиля почкования везикулы с одинаковым диаметром и рисунком окраски обнаруживаются рядом (стрелки). Цветовые модели везикул каждого типа показаны в четвертом столбце ( D , H , L , P и T ). (Масштабные полосы, 50 нм.) Инжир.3. Галерея срезов томограммы, показывающая типы везикул Arabidopsis , соответствующие пяти типам везикул S. dubia . ( A – D ) Везикулы типа COPII. ( E – H ) Везикулы типа COPIa. ( I – L ) Везикулы типа COPIb. ( M – P ) Секреторные пузырьки. ( Q – T ) Везикулы, покрытые клатрином. Профили бутонирования и высвобожденные везикулы показаны во втором и третьем столбцах соответственно. Цветовые модели каждого типа пузырьков показаны в четвертом столбце.Как и у S. dubia , цис- и медиально-транс-цистерны Гольджи дают начало двум морфологически различным пузырькам COPI (COPIa и COPIb). Секреторные и покрытые клатрином везикулы продуцируются из цистерн TGN ( M – P и Q – T ). (Масштабные полосы, 50 нм.) Везикулы типа COPII. Эти пузырьки (рис. A – D и 3 A – D ) являются единственным типом пузырьков, которые наблюдаются отростками от цистерн ER.В S. dubia сайты зачатков везикул ER, которые также известны как переходные сайты ER, видны только рядом с цис-стороной стеков Гольджи (рис. А ). У Arabidopsis и других высших растений пространственные отношения между сайтами почкования ER и стеками Гольджи менее четко определены, поскольку стеки Гольджи очень подвижны (перемещаются по дорожкам актина со скоростью до 4 мкм / с) (25 ) и не поддерживают фиксированное пространственное отношение к сайтам экспорта ER (26).По этим причинам такие ассоциации редко наблюдаются на электронных микрофотографиях шлифов. Пузырьки COPII, продуцируемые у S. dubia , имеют диаметр ≈70 нм, а у Arabidopsis ≈ ≈60 нм (рис. C и 3 С ). Оболочка COPII не очень различается у обоих организмов, но о наличии слоя оболочки свидетельствует более темное окрашивание мембраны вокруг зачатков / пузырьков по сравнению с окрашиванием мембраны ER (рис.2 A и B и 3 A и B ). Покрытие COPII плотно прилегает к мембране, имеет толщину 5,6 ± 1,3 нм (рис. 2). B и 3 B ) и демонстрирует намеки на мелкую глобулярную субструктуру. Содержимое пузырьков всегда слабо окрашено (рис. B и C и 2 B и C ). Чтобы подтвердить идентичность зачатков и везикул COPII, мы выполнили иммунологическое мечение тонких срезов замороженных под высоким давлением клеток корня Arabidopsis , встроенных в Lowicryl HM20, с использованием антител против AtSar1. AtSar1 является гомологом Sar1 GTPase, который регулирует сборку / разборку оболочки COPII и необходим для транспорта ER-to-Golgi у растений (27). Антитела против AtSar1 метили как отпочковывающиеся везикулы COPII, так и везикулы COPII, связанные с цис-стороной соседних стеков Гольджи (рис.5 А ). Везикулы типа COPIa- и COPIb. По определению, пузырьки COPI-типа зачатка из цистерн Гольджи и участвуют как в транспорте везикул Гольджи к ER, так и в транспорте пузырьков Гольджи (4). Чтобы подтвердить, что везикулы, отрастающие из стопок Гольджи Arabidopsis , действительно являются везикулами COPI-типа, у нас есть меченые иммунным золотом тонкие срезы клеток кончика корня Arabidopsis с антителами против At-γ-COP (21). Эти антитела против COPI метили цистернальные зачатки и везикулы по краям цистерн Гольджи цис-, медиального и транс-типа (рис.5 В ). Везикулы типа COPIa- и COPIb продуцируются из почек, которые возникают на цистернах Гольджи, но эти два типа пузырьков происходят из разных цистерн. В частности, зачатки / пузырьки типа COPIa возникают из цистерн цис-Гольджи (рис. E – G и 3 E – G ), тогда как везикулы типа COPIb образуются на цистернах медиального и транс-типа [Рис. 2 I – K и 3 I – K ; вспомогательная информация (SI) Рис.7 и 8 предоставляют еще 20 изображений везикул типа COPIa- и COPIb]. Еще одно отличие касается окрашивания содержимого пузырьков. Как обсуждалось выше, содержимое цистерн цис-Гольджи окрашивается гораздо слабее, чем содержимое медиальных и транс-цистерн Гольджи (Рис. 1). Точно так же зачатки и пузырьки типа COPIa, происходящие из цистерн цис-Гольджи, имеют слегка окрашенное содержимое и легко различимую ограничивающую мембрану (рис. 2). E – G и 3 E – G и SI Рис.7 A – E и 8 A – E ). Напротив, содержимое почек и везикул типа COPIb, которые возникают из темно окрашенных медиальных и транс-цистерн Гольджи, также окрашено в темный цвет (рис. 2). J и K , 3 J и K , SI Рис. 7 F – J и 8 F – J ). Это затрудняет различение ограничивающей мембраны от содержимого везикул в везикулах типа COPIb (рис.2 К и 3 K и SI Рис. 7 F – J и 8 F – J ). Бутонированные везикулы типа COPIa- и COPIb также демонстрируют различную морфологию оболочки, с такими же различиями, как у S. dubia и Arabidopsis (сравните рис. E и F и 3 E и F для COPIa, рис. 2 I и J и 3 I и J для COPIb; сравните также SI Рис.7 и 8). В частности, покрытия типа COPIa, хотя и толще, чем покрытия COPII (11,4 ± 1,8 нм против 5,6 ± 1,3 нм), демонстрируют нерегулярную и менее выраженную архитектуру по сравнению с характерной геометрией покрытий типа COPIb. Покрытие везикул типа COPIb состоит из двух слоев: компактного внутреннего слоя, который плотно прилегает к мембране, и более выраженного концентрического внешнего слоя с тонкими перемычками к внутреннему слою. Общая толщина пальто типа COPIb на зачатках медиального и трансотипа цистерн составляет 17.9-2,5 нм. Интересно, что темный внешний слой оболочки почек типа COPIb не сохраняется на высвободившихся пузырьках (сравните рис. J и K для S. dubia и 3 J и K для Arabidopsis ; см. также SI Рис. 7 и 8). Диаметр пузырьков COPIa- и COPIb-типов одинаков для каждого типа клеток, но различается у разных организмов. Таким образом, везикулы типа COPIa- и COPIb в среднем составляют ≈55 нм в S.dubia , но только ≈45 нм у Arabidopsis (SI рис.9). Везикулы типов COPII-, COPIa- и COPIb ограничены разными зонами вокруг стеков Гольджи. Чтобы дополнительно охарактеризовать различия между пузырьками COPIa- и COPIb-типов, мы нанесли на карту их распределение вокруг стеков Гольджи. Результаты этого анализа проиллюстрированы на рис. 4. A, и B , а цветовая кодировка различных типов везикул показана на фиг.2 и 3. Наиболее поразительным является ограничение двух типов везикул COPI двумя неперекрывающимися зонами как вокруг стопки S. dubia , так и вокруг стопки Arabidopsis Golgi. Данные S. dubia более четкие из-за большего количества пузырьков, окружающих стопку (рис. 4). A ), но такая же пространственная сегрегация очевидна и у образца Arabidopsis (рис. В ). Подробный анализ S.dubia томографические модели показали, что везикулы типа COPIa ограничены пространством вокруг цис-типа цистерн Гольджи и между этими цис-цистернами и соседней мембраной ER с сайтом экспорта ER. Напротив, везикулы COPIb-типа видны только по краям цистерн медиального и транс-типа и в пространстве за пределами транс-большинства цистерн Гольджи, но никогда в пространстве вокруг цистерн. Даже когда эти томографические модели исследуются в трехмерном пространстве, не наблюдается перекрытия между областями, содержащими везикулы типа COPIa- и COPIb.Таким образом, эта сегрегация кажется близкой к абсолютной. Хотя вокруг гораздо меньших по размеру стеков Arabidopsis Golgi везикул гораздо меньше, сегрегация везикул типа COPIa в пространстве вокруг цистерн и везикул типа COPIb в пространстве вокруг медиальных и трансцистерн всегда происходила. наблюдаемый. Инжир.4. 3D-модели томограмм везикул, ассоциированных с Гольджи, показанные на рис. 2 и 3 наложены на один срез стопки Гольджи S. dubia ( A ) и Arabidopsis ( B ). Эти изображения подчеркивают неслучайное распределение пяти различных классов пузырьков, окружающих стеки Гольджи. Распределение везикул типа COPII- (золотой), COPIa- (светло-зеленый) и COPIb (светло-фиолетовый) в S. dubia дублируется в Arabidopsis .(Масштабные полосы, 100 нм.) Пространственная сегрегация везикул COPIa- и COPIb-типов указывает на то, что эти два типа везикул могут передавать разные наборы молекул грузов. Чтобы проверить эту гипотезу, мы использовали иммунологическое мечение двух резидентных белков Гольджи, сиалилтрансферазы, слитой с желтым флуоресцентным белком (ST-YFP), и маннозидазы I (ManI) Arabidopsis (ManI), чтобы определить, локализованы ли эти белки в COPIa, COPIb или обоих типах. пузырьков.ST-YFP-специфические антитела, меченные поздними медиальными и транс-цистернами Гольджи, а также везикулами типа COPIb, но не COPIa (рис. C – F ; см. также SI Movie 1). Сходным образом ManI-специфические антитела, которые связаны только с медиальными цистернами Гольджи, также метят только везикулы типа COPIb (см. SI Рис. 10). Рис. 5. Иммуноэлектронные микрофотографии компонентов оболочки COPII ( A ) и COPI ( B ) в клетках меристемы Arabidopsis ST-YFP в клетках суспензионной культуры табака BY2 ( C – F ). ( A ) AtSar1-специфические частицы иммунного золота видны на поверхности ER и между ER и цис-стороной Golgi. Отросток везикулы, помеченный частицами иммунного золота AtSar1, отмечен стрелкой. ( B ) Ат-γ-COPI-специфичные частицы иммунного золота видны по периферии Гольджи от цис- к транс-большинству цистерн.( C и D ) Иммуноэлектронные микрофотографии ST-YFP в клетках BY2. ST-YFP-специфические частицы иммуногололита ограничены поздними медиальными и трансцистернами. Кластер из пяти частиц иммунозолота, помеченный стрелкой на D , показан при большем увеличении на E и F . ( E ) Изображение томографического среза поверхности среза в D , показывающее кластер частиц иммунозолота (стрелка). ( F ) Изображение томографического среза на ≈15 нм ниже поверхности среза, изображенной на E.Везикула типа COPIb (стрелка) видна под частицами иммунозолота ST-YPF. (Масштабные полосы, 100 нм.) Везикулы типа COPII ограничены пространством вокруг данного сайта экспорта ER и пространством между этим сайтом и соседними цистернами цис-Гольджи, при этом наибольшее количество таких везикул наблюдается вблизи самой цистерны цистерны (рис. . 4 A и B ). В целом, распределение везикул типа COPII соответствует распределению везикул типа COPIa как в S.dubia и Arabidopsis . Пузырьки секреторного типа и покрытые клатрином везикулы ограничены определенными областями вокруг транс-Гольджи и TGN цистерн. Существуют значительные различия в пространственной и функциональной организации компартментов мембраны postGolgi у S. dubia и Arabidopsis , которые связаны с различными секреторными механизмами, используемыми этими двумя организмами. Таким образом, вся продукция S.dubia Гольджи, по-видимому, секретируются в трубчатую мембранную систему, которая является частью сократительного вакуольного аппарата (рис. A ) (24), тогда как в клетках Arabidopsis все продукты, по-видимому, попадают в TGN (рис. B и 4 В ) (28). Тем не менее, обе системы продуцируют два структурно различных типа везикул, везикулы секреторного типа и везикулы, покрытые клатрином (рис. 2). M – T и 3 M – T ). В S. dubia везикулы секреторного типа (рис. M – O ) генерируются транс-самой цистерной стека, которая демонстрирует заметное отсутствие окрашивания его цистернального содержимого, за исключением жгутиковых и текальных чешуек (рис. 1). А ). Эти везикулы диаметром ≈72 нм имеют тонкую оболочку (сравните окрашивание зачатка и прилегающих участков цистернальной мембраны на рис. N ) и слегка окрашенное содержимое (рис.2 N и O ). Везикулы секреторного типа Arabidopsis зачаток из цистерн TGN обычно после того, как они отделились от стека Гольджи (рис. B и 3 В ). Диаметр этих везикул существенно различается (65–100 нм), как и окрашивание их содержимого, хотя большинство из них содержит слабо окрашенные молекулы груза (рис. 3). N и O ).Окрашивание тонкой оболочки секреторных пузырьков аналогично окрашиванию сопоставимых пузырьков у S. dubia . У S. dubia везикулы, покрытые клатрином, видны на трубчатых элементах сократительной системы вакуолей (рис. А и 2 Q – S ), тогда как у Arabidopsis они возникают на цистернах TGN (рис. 1 Б , 3 Q – S и 4 В ).Хотя структура клатриновых оболочек на томографических изображениях обоих организмов очень похожа, диаметры пузырьков сильно различаются: ≈55 нм у S. dubia и ≈35 нм у Arabidopsis . И у S. dubia , и у Arabidopsis секреторные и покрытые клатрином везикулы ограничены транс-стороной стеков Гольджи и вблизи цистерн TGN (рис. 4). A и B ).Некоторое смешение везикул типа COPIb с секреторными и покрытыми клатрином везикулами также наблюдается в этих регионах, особенно в S. dubia. Обсуждение Везикулы COPI обеспечивают два типа транспорта: рециклинг молекул от Гольджи к ER (4) и транспорт внутри Гольджи (29). Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы изучить структурную основу этих двух путей переноса с помощью электронной томографии замороженных под высоким давлением клеток водорослей и растений.Мы выделили два различных класса везикул COPI, обозначенные как везикулы COPIa и COPIb, которые можно различить на основе комбинации шести различных морфологических критериев. Мы также продемонстрировали, что везикулы COPIa и COPIb транспортируют различные типы грузовых белков. Вместе с выводами других авторов (10, 30, 31) наши результаты предполагают, что везикулы типа COPIa, которые передаются от Гольджи к ER, составляют подкласс везикул COPI, которые как структурно, так и композиционно отличаются от везикул типа COPIb, которые посредничать в торговле людьми внутри Гольджи.Пространственная сегрегация этих двух типов везикул согласуется с гипотезой о том, что диффузия везикул периГольджи ограничена (7). Почки и пузырьки COPII и COPI могут быть эффективно иммуномечены в замороженных под высоким давлением клетках и клетках, встроенных в клетки с низким содержанием HM20. Существует общее мнение, что клетки, сохраненные методами криофиксации, предоставляют более надежную структурную информацию о динамических мембранных системах, чем клетки, сохраненные химическими методами (32, 33).Действительно, почки COPII могут быть визуализированы только в растительных клетках, сохраненных замораживанием под высоким давлением, но никогда в химически фиксированных клетках (34-36). Однако было заявлено, что в образцах, сохраненных замораживанием под высоким давлением, замораживанием-замещением и заливкой смолой, везикулы COPII и COPI теряют свою антигенность, и что мечение таких везикул может происходить только в химически фиксированных образцах, приготовленных методом Токуясу (2, 21, 37). Здесь мы демонстрируем, что COPII, везикулы COPI и грузовые белки в везикулах COPI могут быть эффективно помечены в замороженных под высоким давлением и замороженных клетках кончика корня Arabidopsis , заключенных в Lowicryl HM20 при -60 ° C (рис.5 и SI рис.10). Эти эксперименты по иммуномечению также доказывают, что структурно различные почки и пузырьки, обозначенные COPII и COPI на наших изображениях электронной томографии Arabidopsis (рис. 3), содержат ожидаемые белки оболочки. Цистерны Цис-Гольджи дают рост везикулам типа COPI, которые структурно отличаются от везикул типа COPI, которые зарождаются из медиальных и транс-цистерн Гольджи. Пузырьки, образующиеся из цистерн Гольджи, известны как пузырьки COPI, потому что они имеют общие белки оболочки типа COPI.В зависимости от модели трафика Гольджи, созревания цистерны по сравнению с челноком везикул, постулируется существование двух или трех функциональных типов везикул COPI (29). Таким образом, в секретирующей чешуйку водоросле S. dubia , чьи Гольджи служат прототипами для трафика Гольджи в соответствии с моделью цистернального созревания (13, 15), можно ожидать, что будут наблюдаться два типа везикул COPI. Поскольку стеки Гольджи растений, по-видимому, перемещают свои грузовые молекулы по одному и тому же механизму (18, 36, 38), они также должны обладать двумя функциональными типами везикул COPI: те, которые рециркулируют молекулы из Гольджи в ER, и те, которые участвуют в ретроградном транспорте. в стопках. И S. dubia , и Arabidopsis Golgi дают начало двум различным типам везикул типа COPI, которые проявляют одинаковые морфологические особенности у двух организмов (рис. 2 и 3 и рис. 7 и 8 SI). В частности, везикулы, обозначенные как COPIa, обладают слегка окрашенным ядром, подобным слегка окрашенному просвету цис-цистерн, из которых они отпочковываются, четко видимой мембраной и оболочкой толщиной ≈11 нм с характерной архитектурой. Напротив, все везикулы, обозначенные COPIb, имеют темные ядра, похожие на темное просветное содержимое медиальных и трансцистерн, из которых они отрастают, пограничную мембрану, которую трудно различить, и характерную двухслойную оболочку, которая имеет толщину ≈ 18 нм.Кроме того, везикулы типа COPIa- и COPIb занимают одни и те же субдомены вокруг стеков Гольджи у обоих организмов. Единственное систематическое различие между пузырьками COPI у этих двух организмов заключается в их размере, ≈55 нм в диаметре у S. dubia и ≈45 нм у Arabidopsis . Преимущество использования этого многопараметрического структурного подхода для идентификации различных типов везикул периГольджи по сравнению с методом иммуномечения Токуясу состоит в том, что он позволяет точно идентифицировать почти 100% везикул (рис.2–4) по сравнению с гораздо меньшим процентом в иммуномеченых образцах. Отрастание везикул COPI может быть восстановлено in vitro с использованием частично очищенных мембран Гольджи из печени крыс (39). Анализ полученных везикул показал, что они бывают двух типов: везикулы, обогащенные белками семейства p24, которые циркулируют между ER и Гольджи, и везикулы, в которых такие белки отсутствуют, но которые обогащены резидентными ферментами Гольджи (30, 31). Кроме того, два типа везикул также проявляют разное сродство к факторам привязки, связанным с Гольджи (31).Эти различия согласуются с идеей о том, что везикулы, обогащенные p24, соответствуют везикулам типа COPIa, которые локализуются в области между сайтами экспорта ER и цистернами цис-Гольджи, а везикулы, обедненные p24 и обогащенные ферментом Гольджи, относятся к типу COPIb. везикулы вокруг цистерн медиального и транс-типа. Martinez-Menarguez et al. (10) предоставили доказательства с помощью иммунной метки двух типов везикул пери-Гольджи, участвующих в рециркуляции резидентных белков Гольджи в нормальных эпителиальных клетках почек крысы, причем один тип опосредует транспорт внутри Гольджи, а другой рециркулирует резидентные белки Гольджи в ER.Наши данные подтверждают первую, но не вторую из этих гипотез (см. Ниже). Ретроградный транспорт ферментов Гольджи везикулами типа COPIb ограничен медиальными и транс-цистернами Гольджи. Одним из наиболее поразительных открытий этого исследования является неперекрывающееся распределение пузырьков COPIa- и COPIb-типа вокруг стеков Гольджи, а также корреляция этого распределения с цистернальными типами и паттернами транспортировки грузов (Figs. 4-6). Хотя цистернальные типы были первоначально идентифицированы с помощью структурных критериев (17), было показано, что цистерны, идентифицированные таким образом, соответствуют функционально различным цистернальным типам (40), и аналогичные результаты были получены для дрожжей P.пасторис (23). Ограничение везикул типа COPIa в области между цистернами цис-типа и сайтами экспорта ER подтверждает ожидания везикул рециклинга Golgi-to-ER (4), в то время как исключение везикул типа COPIb из той же области и их приуроченность к регионам, непосредственно прилегающим к цистернам медиального и транс-типа, дает представление о трафике внутри Гольджи. Во-первых, рециклинг от Гольджи к ER должен происходить только из цис-цистерн, а не медиальных и трансцистерн (рис.6), что согласуется с данными рециркуляции для белков, меченных удерживающей последовательностью Arabidopsis ER (41). Во-вторых, ретроградный транспорт резидентных ферментов Гольджи по существу ограничен медиальными и транс-цистернами Гольджи (Рис. 6). В самом деле, ретроградный транспорт медиальных ферментов Гольджи в транс-наиболее цис-цистерну может даже определять трансформацию цистерны цис-Гольджи в медиальную цистерну, и можно ожидать, что соответствующий этап ретроградного транспорта в транс-самой медиальной цистерне приведет к дают начало новой транс-цистерне. Рис. 6. Модель, обобщающая сайты происхождения и паттерны трафика пяти ER / Golgi / TGN (CV) -ассоциированных классов везикул, описанных в этой статье. Обратите внимание на пространственную сегрегацию пузырьков COPIa и COPIb. Цистерны цис-Гольджи собирают цистерны, которые продуцируют везикулы COPI, которые отличаются по паттерну доставки от тех, которые происходят на медиальных и трансцистернах. Материалы и методы Замораживание и замена замораживания при высоком давлении. d-Манит (Sigma, Сент-Луис, Миссури) добавляли к культуральной среде S. dubia в качестве внешнего криопротектора до конечной концентрации 100 мМ за 1 час до замораживания. Культуры роста в лог-фазе собирали центрифугированием, и осадки клеток быстро замораживали в морозильнике высокого давления BAL-TEC HPM-010 (BalTec / RMC, Tucson, AZ).Замещение замораживанием выполняли в 2% OsO 4 / 0,5% уранилацетата в безводном ацетоне при приблизительно -80 ° C в течение 4 дней. Затем образцы постепенно нагревали до комнатной температуры в течение следующих 2 дней. После доведения образцов до комнатной температуры их трижды промывали в сухом ацетоне, вынимали из планшетов и медленно пропитывали растущими концентрациями смолы Epon (Ted Pella, Redding, CA) в течение 4 дней (42). Образцы, пропитанные смолой, полимеризовали в вакууме при 60 ° C в течение 48 часов. Кончики корней проростков Arabidopsis замораживали и заменяли замораживанием, как описано в Segui-Simarro et al. (43). Для иммуномечения белков замороженные кончики корней замораживали в ацетоне с 0,2% уранилацетатом и 0,25% глутаровым альдегидом при -90 ° C в течение 4 дней и медленно нагревали до -60 ° C в течение 6 часов. После трех промывок ацетоном образцы пропитывали Lowicryl HM20 (Electron Microscopy Sciences, Форт Вашингтон, Пенсильвания) при -60 ° C следующим образом: 1 день каждый в 25%, 50% и 75% HM20 в ацетоне.После трех замен свежего 100% HM20 в течение 2 дней образцы полимеризовали при -60 ° C в УФ-свете в течение 24 часов. Иммуномечение AtSar1, At-γ-COP, ST-YFP и ManI. Anti-AtSar1 (Rose Biotech, Hayward, CA) (18), анти-At-γ-COP (21) и анти-ManI (44) антитела были использованы для обнаружения AtSar1, At-γ-COP и ManI в Arabidopsis клеток корневой меристемы соответственно. ST-YFP был обнаружен в клеточной линии BY2, экспрессирующей ST-YFP с помощью антитела против GFP.Срезы залитых HM20 образцов блокировали 2% обезжиренным молоком в PBST (PBS плюс 0,1% Tween 20). Антитела разводили 1:20 в 1% обезжиренном молоке в PBST, и срезы инкубировали с разведениями антител в течение 1 ч при комнатной температуре. После трех промываний в 1% обезжиренном молоке в PBST срезы инкубировали со вторичным антителом (антикроличий IgG, конъюгированный с частицами золота 15 нм, разведенный 1:20 в 1% обезжиренном молоке в PBST) в течение 1 часа. После тщательной промывки иммуномеченые образцы подвергали последующему окрашиванию, как описано в Segui-Simarro et al. (43). Другие методы. Условия для культивирования S. dubia и роста Arabidopsis , общие процедуры электронной микроскопии, двухкоординатной серии изображений наклона и методы реконструкции / моделирования томограмм представлены в SI Текст . Благодарности Мы благодарим доктора Дэвида Робинсона (Гейдельбергский университет, Гейдельберг, Германия), доктораСебастьяну Й. Беднареку (Университет Висконсина, Мэдисон, Висконсин) и доктору Андреасу Небенфюру (Университет Теннесси, Ноксвилл, Теннесси) для анти-At-γ-COP, антител против ManI и линии клеток BY2, экспрессирующих ST- YFP соответственно. Мы также благодарим сотрудников лаборатории Staehelin и лаборатории Boulder за 3D-ЭМ клеток, технические советы и полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантом GM-61306 Национального института здравоохранения (L.A.S.). Сноски † Кому следует направлять корреспонденцию.Эл. адрес: kangb {at} colorado.edu Вклад авторов: B.S.D. и Б.-Х.К. внес равный вклад в эту работу; B.S.D., B.-H.K. и L.A.S. спланированное исследование; B.S.D. и Б.-Х.К. проведенное исследование; B.S.D., B.-H.K. и L.A.S. проанализированные данные; и B.S.D., B.-H.K. и L.A.S. написал газету. ↵ * Нынешний адрес: Национальная лаборатория возобновляемых источников энергии, 1617 Cole Boulevard, MS 3323, Golden, CO 80401. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/cgi/content/full/0609818104/DC1. Сокращения: ER, эндоплазматический ретикулум; COP, белок оболочки; TGN, сеть транс-Гольджи; ST-YFP, сиалилтрансфераза, слитая с желтым флуоресцентным белком; ManI, маннозидаза I. © 2006 Национальная академия наук США Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт. Настройка вашего браузера для приема файлов cookie Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины: В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie. Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie. Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер. Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере. Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором. Почему этому сайту требуются файлы cookie? Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня. Что сохраняется в файле cookie? Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется. Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт