Содержание

Как сделать ворота из металлического листа

В наше время разнообразие строительных материалов для изготовления ворот поразит даже самого привередливого домовладельца. Как показывает практика, наиболее востребованным для обшивания ворот является профилированный лист. Такое отношение к себе он заслужил благодаря удобству при монтаже, практичностью, современному виду и относительно небольшой стоимости. В то же время если дом или дачный участок уже имеет забор из профнастила, то выбор материала для обшивки распашных ворот однозначно будет сделан в его пользу.

Ворота из профнастила обладают повышенной прочностью и прекрасным внешним видом

Большинство владельцев частных домов склоняются к тому, чтобы изготовить ворота именно своими руками с минимально затраченными денежными ресурсами. На первый взгляд соорудить ворота довольно сложно, но специалисты в этом деле, уверяют, что в этом нет ничего сложного. Самое главное то, что перед тем, как начать делать ворота из профиля, необходимо правильно подойти к выбору материалов для изготовления каркаса и фурнитуры, инструмента и, конечно же, самому начертить или где-то раздобыть их чертеж.

Проектирование ворот из профилированного листа

Проектирование (чертежи) ворот независимо от того, какой они конструкции, всегда начинается с определения отведенного участка для возведения ворот. Здесь главную роль играют его расположение и длина. Самый распространенный размер распашных ворот составляет 3,5-4 метра и 2,5 метра в высоту. Такие размеры обусловлены тем, что позволяют беспрепятственно въехать во двор легковой или даже грузовой машине, небольших габаритов, не испытывая затруднения.

Следует учесть то, что схема ворот также должна включать расположение и габариты калитки.

Схема ворот из металлопрофиля.

В некоторых условиях, когда участок под ворота ограничен, калитка может совмещаться с одной из створок ворот. При конструировании ворот желательно учесть, куда будут открываться створки ворот вовнутрь или наружу. Далее в зависимости от размера и габаритов материала тщательно составляется чертеж. Любой такой чертеж будет представлять собой схематический каркас калитки, правой (левой) створок распашных ворот, и расположение двух (трех при расположении калитки отдельно) столбов. Вот так представляется классический вариант ворот.

Задавшись целью, не трудно будет найти огромное количество конструкций ворот из профнастила. Всевозможные варианты объединяет то, что все конструкции имеют ребра жесткости, как в калитке, так и в створках ворот. Наличие этих ребер жесткости ни в коем случае нельзя игнорировать, потому как каркас может утратить жесткость, портя, таким образом, внешний вид. Чтобы чертеж был правильным, необходимо принять во внимание тот факт, что ворота могут устанавливаться на старое место, где уже имеются столбы, или их нужно будет изготовить заново. В первом случае обращается внимание на точность измерения пролета, иначе ворота просто могут не поместиться.

Необходимые материалы для изготовления каркаса ворот

Схема устройства каркаса ворот.

Естественно, чтобы ворота стояли долго и прочно, необходимы хорошие столбы. В идеальном варианте лучше использовать металлические изделия такие, как балка швеллерная (14-16 мм) или труба д.100-120 мм. Когда ворота монтируются на старые столбы, то может понадобиться профилированная труба 40х60 мм для последующего закрепления на уже существующем столбе.

Каркас створок распашных ворот рекомендуется сделать из профилированной трубы 40х40 мм. В зависимости от размера ворот конструктивно предусмотренные параллельные или раскосые распорки изготавливаются ииз профилированной трубы 20х20 мм. Материал для калитки используется тот же, что и для створок. Дополнительные материалы, которые понадобятся, будут включать завесы для ворот и калитки (диаметр не менее 25 мм), задвижка, стопоры, замок, саморезы (болты, заклепки) и песок с цементом (бетон). При желании для того, чтобы украсить ворота, можно приготовить кованые изделия.

Не маловажен тот факт, что при приобретении профиля для отделки распашных ворот нужно учесть расположение волны профиля. Это необходимо сделать для того, чтобы при монтировании совпали листы профнастила и по возможности не заканчивались выпуклой частью на срезе каркаса. Порой лучше изменить размеры на несколько сантиметров (внести корректировки в чертеж) или взять лишний лист профнастила, чем потерять в изысканном виде ворот и калитки.

Разработанная ранее схема ворот содержит все необходимые размеры для точного подсчета необходимого материала.

Перечень необходимого инструмента

Металлические составные каркаса рекомендуется отрезать болгаркой.

  1. Болгарка с достаточной мощностью для порезки и шлифовки металлических частей каркаса.
  2. Отрезные круги и жесткая металлическая щетка для болгарки.
  3. Сварочный аппарат.
  4. Электроды (3-4 мм).
  5. Угольник.
  6. Рулетка.
  7. Линейка.
  8. Чертилка (мел).
  9. Шуруповерт (заклепочник).

Металлические составные каркаса рекомендуется отрезать болгаркой с диаметром круга 230 мм. При использовании такой болгарки уменьшается время и усилие, затраченное на резку составных частей каркаса.

Металлические детали лучше всего сваривать инверторным аппаратом 160-200А.

Как сделать ворота самому

В первую очередь нужно еще уяснить то, что не нужно пренебрегать проверенными конструкциями ворот из профнастила и при возможности использовать именно их.

Затем, так как инструменты и материалы приготовлены, можно приступать к изготовлению и последующей установке ворот. Единственно, что нужно еще сделать перед началом работ, это взять чертеж и еще раз проверить все размеры каркаса створок и калитки.

Схема монтажа столбов из профиля для ворот.

Далее в соответствии с чертежом нужно нарезать металлические части и при помощи сварки соединить их в соответствии со схемой. Для того чтобы качество работ было выполнено на должном уровне, необходима ровная поверхность, на которой будут проводиться сварочные работы. Как правило, сваренный на неровном основании каркас имеет погрешность в пропорциях и схема ему не будет соответствать.

Затем, в первую очередь, располагаются все металлические части, которые должны создать прямоугольную конструкцию. От правильной сварки этих деталей из состава створок и калитки зависит правильность дальнейшей сборки в целом. Чтобы угол между составными частями был равен 90 градусов, рекомендуется сделать следующее приспособление, сбить под прямым углом два бруска. Чтобы не ошибиться, нужно постоянно сверять чертеж и собираемую конструкцию.

Когда каркас по периметру собран, для придания ему вертикальной жесткости ввариваются распорки. По диагонали варятся распорки, если ворота больше четырех метров, в других случая достаточно и параллельных земле распорок.

Принцип изготовления калитки такой же, как и створок ворот, только в уменьшенном исполнении.

Следующий немаловажный этап это установка столбов. Для установки столбов рекомендуется выкопать ямы с глубиной 2/3 части столба, которая будет находиться над поверхностью. В тоже время необходимо учесть и то, что столбы должны возвышаться над створкой ворот на 50 см, а нижний край ворот и калитки должен быть приподнят на 2-30 см.

Для швеллера яма должна быть минимум один м в глубину. На дно ямы засыпается мелкий гравий, хорошо трамбуется и заливается бетоном. Так как до полного высыхания раствора может пройти целый месяц, поэтому в этот период необходимо постоянно контролировать вертикаль столбов. Не стоит забывать, что швеллер должен быть повернут вовнутрь плоской стороной. После того как конструкция собрана, необходимо покрасить все металлические ее части предварительно зачистив места стыков (сварных швов) и обезжирив растворителем (бензином). Красить нужно обычной масляной краской выбранной под цвет профилированного листа.

Заключительным этапом в изготовлении распашных ворот, является обшивка каркаса профилированным листом. Рекомендуется крепить профилированный лист на шурупы с шестигранной головкой. Основная задача при прикручивании профилированного листа подогнать его под размеры каркаса и уложить внахлест друг на друга со смещением в одну волну. Обращается внимание на то, чтобы профилированный лист прикручивался поверх ранее приваренных петель.

При желании ворота можно украсить коваными изделиями, которые придадут дополнительную привлекательность и эстетику.

Ворота из профиля изготовленные своими руками будут гордостью каждого хозяина и прекрасно украсят любой двор.

Ворота из профнастила в Уфе. Изготовление и монтаж под ключ

Ворота из профнастила в Уфе

 

  • Высота: 1,5 / 1,7 / 1,8 / 2 и более метра
  • Покрытие сетки: Оцинкованная / ПВХ покрытие
  • Столбы  60х30 / 60×40 / 60х60
  • Установка столбов:  заглубление / бетонирование / бутование гравием / винтовые сваи
  • Арматурные протяжки:  d10 мм в 1-2 ряда
  • Цвет:  грунтовка гф021 + покраска (цвет на выбор)

От 15000 р.

 

Еще одним надежным и верным решением при обустройстве въездной группы станет выбор в пользу в ворот из профнастила. В нашей компании большой выбор интереснейших вариантов, которые вы можете не только выбрать, но и заказать с установкой под ключ.

Ворота из профнастила с ковкой, профилированный лист обладает целым рядом преимуществ, поэтому, сегодня этот вид ворот считается достаточно популярным и конкурентным среди своих собратьев по назначению. Профлист огнеупорный, сплошной (непрозрачный), недорогой, приспособлен к внешним природным факторам, не нуждается в повторной покраске и т.д. Если вы желаете именно этот вид  ворот – закажите их у нас!

Ворота из профнастила с элементами ковки, такие конструкции прекрасно смотрятся на дачах, загородных домах, складских и производственных участках. Закажите услугу в нашей фирме, и профессиональные монтажники выполнят качественную установку ворот за один день. Устойчивость и прочность профнастила обеспечат воротам красивый внешний вид и добавят больше привлекательности территории. Звоните!

Ворота для дома из профнастила

Ворота калитки из профнастила достаточно солидно смотрятся на любом участке, в том числе и около частного дома. Если вы ищете выгодное предложение с привлекательными ценами, опытными строителями и качественным материалом – наша компания всегда к вашим услугам! Мы гарантируем длительный период службы ворот и легкость в эксплуатации. Сделать свою жизнь комфортнее можете лишь вы. Так закажите прямо сейчас стильные ворота из профлиста!

  • Ворота для частного дома из профнастила — наша профильная компания обладает огромным стажем и опытом в этой сфере, поэтому самые нестандартные вопросы, нюансы и сложности, возникающие в процессе монтажа, нас не сбивают с толку. Мы всегда знаем, как и что делать в любой ситуации. Мы можем поставить двусторонние ворота из профнастила или односторонние по вашему желанию и выполним работу аккуратно и в соответствии со сроками, прописанными в договоре.
  • Ворота заборы из профнастила — пригласите прямо сегодня мастера для составления грамотного и технологичного чертежа, получения всей необходимой информации и консультации. Мы всегда делимся с нашими клиентами бесценными советами, которые помогут сэкономить семейный бюджет и при этом не потерять качество заказанного продукта. Ждем вас по телефону!
  • Ворота из профнастила Уфа — различные цвета, модификации, размеры открывают нам самые неординарные решения в оформлении территории. Если вы затрудняетесь с выбором, просто обратитесь к нашему дизайнеру, который поможет остановиться на самом подходящем варианте. Оформляйте свой участок красиво вместе с нами!

Установка ворот из профнастила

Распашные ворота из профнастила, откатные, с декоративными коваными элементами в любое время могут стать украшением любого места.  Будь то жилой частный дом или административное здание. Для большей защиты профилированный профиль может быть покрыт дополнительными защитными средствами с обеих сторон. Поинтересуйтесь прямо сейчас подробностями этого типа ворот и получите четкие и понятные ответы на свои вопросы.

Ворота из профнастила купить, наша цель – установить ворота таким образом, чтобы клиент был абсолютно доволен результатом. Поэтому мы ставим конструкции, которые усилены дополнительными балками. В монтаже наши специалисты используют проверенную годами качественную фурнитуру. В кратчайшие сроки мы произведем монтаж и предоставим именно тот результат, которого вы так долго ждали!

Красивые ворота из профнастила, у нас вы имеете возможность заказать не только металлические ворота. Но и недорогие калитки из металла с комплектом необходимой фурнитуры. Свяжитесь с нашим сотрудником и пригласите замерщика на объект, и он непременно поможет вам профессиональным советом и предложит выгодные условия дальнейшего сотрудничества.

Вороты из профнастила цена с установкой

Стоимость – один из решающих факторов, который в первую очередь привлекает внимание потребителя. Поэтому в нашей компании клиентов на установку этого типа ворот всегда было и будет больше. Все дело в том, что, несмотря на недорогие цены, этот материал прошел проверку на прочность и может эксплуатироваться на протяжении долгого периода. Цены на каждую модель индивидуальны, поэтому звоните и спрашивайте подробности у оператора.

Откатные ворота из профнастила

Ворота раздвижные откатные – современный и прочный способ оформить въездную группу, значительно экономя место при узких проемах или рядом проходящей дороге. Сэкономленное пространство всегда приятно использовать, особенно если его и так совсем мало. Мы установим для вас ворота на расстоянии от 10 см от поверхности для того, чтобы в зимний период ничего не препятствовало комфортной эксплуатации. Звоните!

Купить ворота с калиткой из профнастила цена, синие, бардовые, зеленые, коричневые – любые ворота из металлического профиля смотрятся красиво, сильно и современно. При всей своей эстетике они надежно защищают вход и въезд  от  непрошеных посетителей. Если вы – именно тот, кто ценит высокое качество, приятные цены, быстроту сборки и долгую службу, такой вариант станет прекрасным выбором.

Калитка профнастил, эти конструкции пользуются не меньшим спросом. Заказывая калитку из профнастила в Уфе, помните, что монтаж важно доверять только высокоспециализированным компаниям со штатом специалистов высокой категории. Только опытный работник сможет выполнить монтаж с соблюдением всех норм, о которых не знает новичок. Звоните и оставляйте заявку!

Ворота профнастил, которые мы разработаем любой эскиз и составим проект в соответствии с вашими затеями и воплотим его в реальном времени. Если у вас отсутствует свободное время, мы самостоятельно рассчитаем материал. Организуем доставку, выполним сборку и уберем за собой всю территорию.

Ворота профлист  станут украшением и защитой на долгие годы вашей счастливой жизни. 

Ворота распашные из профнастила своими руками чертежи

Нынешнее разнообразие стройматериалов, подходящих для изготовления ограждений и ворот, может озадачить любого застройщика. Но наиболее подходящим вариантом будет распашные ворота выполнить из профнастила своими руками. По факту, профнастил будет применен только для обшивки основы створок распашных ворот.

Профильный лист — это оцинкованный лист, имеющий ребристую форму, которая усиливает его жесткость. Эти листы изготавливают как оцинкованными, так и с покрытием из полимера, что избавляет владельца от потребности красить распашные ворота из профнастила после установки, а также в период их эксплуатации.

Такие ворота имеют две части и открываются в обе стороны. Именно по этой причине их и называют «распашными воротами». Две створки делают для того, чтобы уменьшить нагрузку на петли и облегчить открывание ворот.

Для того, кто хочет, чтобы все, что только можно, было сделано своими руками, нет нужды устанавливать громадные распашные ворота. Для проезда машины хватит того, чтобы ворота из профнастила были шириной 4 м, а высотой — 2.5 м. Такие габариты дают возможность при оборудовании ворот обойтись без посторонней помощи.

Распашные ворота, выполненные из профнастила, обладают преимуществами:

  • удобство и надежность;
  • достойный вид;
  • простота в использовании и несложная установка.

Монтаж ворот из профнастила

Материалы и инструменты

Распашные ворота бывают разных видов, владелец может дополнить их декоративными деталями. Необходимо продумать внешний вид и разработать чертежи, выбрать место для обустройства, вымерять размеры. Тогда будет ясно, какой необходим инструмент и материал.

Необходимые материалы:

  • профнастил (согласно расчетам). При расчетах непременно учитывается длина и ширина листов, которую сравнивают с готовым изделием. Не стоит брать впритык. При крепеже необходимо будет делать внахлест;
  • труба для столбов. К высоте изделия прибавляется еще метр — расстояние, заливаемое бетоном;
  • при покупке материала необходимы ребра жесткости для изготовления деталей. Если для их выполнения берется материал, идентичный раме, добавляется еще и длина ребер;
  • для основы нужна труба из профиля. Ее следует приобретать диаметром более 25 мм;
  • пригодится бензин или средство против коррозии, чтобы покрыть поверхности из металла;
  • грунтовка и краска;
  • засов или замок.

Необходимый инструмент:

  • нить из капрона;
  • электросварка;
  • кувалда;
  • шуруповерт;
  • болгарка;
  • ножницы по металлу.

При планировании требуют внимания размеры сооружения. Большие — повлияют на массу, раму тогда лучше сделать из более мощного материала. Для беспрепятственного движения створок необходимо оставить запас на накопление снега в виде расстояния между землей и воротами.

Установка столбиков

Части ворот будут монтироваться своими руками к столбам, поэтому сначала их устанавливают в землю приблизительно на один метр. Также осуществляется разметка и выкапываются ямы под столбы. Размер ямы должен на 10 см превышать диаметр трубы. Далее отрезается материал, равный по длине створке, плюс 10 см для снега и метр для монтажа. Обезжиривается он посредством бензина и противокоррозийного состава. Когда состав высохнет, необходимо снять появившийся налет тряпкой.

Столбы помещаются в подготовленные ямы и своими руками засыпаются щебнем, который необходимо утрамбовать. Установку столбов выполняют строго вертикально. Для этого необходим отвес. После застывания раствора недочет может не получиться исправить. Для раствора берется цемент марки 300 в соотношении 1:3. Он перемешивается, добавляется вода, посредством которой состав доводится до жидкого состояния. Этой смесью заливают щебень. Необходимо дождаться полного затвердения оборудованных элементов.

Изготовление створок для ворот своими руками

На этой стадии следует контролировать соблюдение формы деталей. Если это проигнорировать, то после изготовления возникнет расхождение плоскостей, а устранить изъян будет нельзя. Вот почему с самого начала нужно следить за составлением конфигурации.

Подготовка места для работ

Грамотно изготовить распашные ворота своими руками без специально отведенного места не получится. Хорошо, когда имеется стол для сварки, если его нет, необходимо найти другое место. Понадобится ровная площадка, размеры которой больше, чем у изделия на несколько метров. Теперь необходимо разложить швеллер. Он должен быть меньше изделия на 20 см. При укладке пользуются уровнем. Должна получится ровная плоскость и абсолютно параллельная. Если нарушить это требование, то после скрепления частей получится пропеллер, который не исправить.

Изготовление распашных ворот своими руками

Профиль обрезается посредством болгарки согласно запланированным размерам. На срезе убираются заусенцы тоже болгаркой. Заготовки раскладываются на месте сварки. Далее осуществляется стыковка частей и выверяется диагональ. Это делается нитью. Детали схватываются сваркой. При сварке части изделия может повести, поэтому осуществляется повторный промер. Если это случилось, выполняется рихтовка молотком. После приваривают детали полностью. Сварочные наплывы зачищают.

Для жесткости сооружения требуется своими руками закрепить распорки. При изготовлении ворот из профнастила используют металлические узоры для распорки. Если в воротах планируется калитка, то после изготовления основы створки, вырезают заготовки по размеру калитки, выкладывают их на месте осуществления сварки и соединяют по принципу створки. Теперь калитка прикрепляется посредством сваривания к основе створки ворот.

Затем стоит примерить замок и сделать необходимые отверстия. После крепления профиля это сделать намного сложнее. Также, если в планах есть установка автоматики для ворот, закрепляют ригели и рычаги для открывания. Эти детали монтируются в соответствии с инструкцией. Осуществить процедуру требуется непременно до монтажа профнастила.

Далее проводится зачистка всех наплывов сварки и обработка поверхности бензином. После высыхания поверхность протирают тряпкой.

Крепление створки к столбам

Завесы используют мощные. Если этим пренебречь, то створки ворот провиснут. Лучше использовать завес с подшипником, это позволит плавно двигаться частям ворот.

Обязательно предусматривается расстояние между землей и воротами больше 10 см. Это упредит проблемы с воротами из профнастила зимой.

Крепление профнастила своими руками

Для установки профнастила своими руками следует надеть рабочие рукавицы, т.к. при работе с материалом на нем появляется острая кромка. Из профлистов вырезается размер согласно плану. После чего проводится срезка заусенцев в местах обрезки. Листы располагаются внахлест. Посредством дрели просверливаются отверстия, и производится закрепление саморезами. Крепить заклепками нельзя, т.к. они быстро расшатываются и срезаются при использовании ворот.

Распашные ворота готовы. Их следует смазывать перед холодами, чтобы сооружение, сделанное своими руками и потребовавшее столько сил, служило долго.

 

Обзор Gate.io 2022 – Forbes Advisor

Неопытные инвесторы или те, кто только начинает, скорее всего, будут ошеломлены Gate.io, и они, вероятно, будут разочарованы невозможностью внести фиатную валюту, например доллары США, для покупки криптовалюты непосредственно на платформе. Если у вас еще нет монет, вам нужно будет использовать другую биржу, чтобы купить криптовалюту, а затем перевести ее на платформу, прежде чем вы сможете начать торговать.

Gate.io недавно представила возможность покупки криптовалюты через сторонних партнеров, используя платежи по дебетовой или кредитной карте в фиатных валютах.Партнеры переводят вашу криптовалюту на счет Gate.io, но этот процесс требует невероятно высоких комиссий.

Криптоинвесторы и новички, которые предпочитают использовать фиатную валюту для покупки криптовалюты без посредников, лучше обслуживать такие платформы, как Binance.US и Coinbase, которые значительно упрощают и удешевляют процесс.

С другой стороны, изобилие торгуемых монет Gate.io и конкурентоспособные комиссии делают ее достойной платформой для продвинутых трейдеров, которые хотят гоняться за менее известными монетами на централизованной бирже и не возражают против того, что они будут ограничивается спотовой торговлей.Это означает отсутствие маржи, фьючерсов, опционов, крипто-кредитования или ставок, и важно отметить, что некоторые монеты могут быть недоступны в определенных местах в зависимости от того, внес ли их Gate.io в белый список для этой области.

Тем не менее, даже трейдеры, которые соответствуют этим ограниченным параметрам, захотят убедиться, что они смогут успешно выполнить требования Gate.io «Знай своего клиента» (KYC), прежде чем вносить какую-либо свою криптовалюту. Процесс KYC, стандарт для большей части индустрии криптообмена, направлен на снижение риска использования средств в незаконных целях или в целях отмывания денег путем подтверждения пользователями своей личности.Вы должны пройти KYC Gate.io, прежде чем сможете вывести что-либо со своей учетной записи.

Помните, что криптовалюта — это чрезвычайно волатильный класс активов, цены на который могут сильно колебаться. Криптобиржи не защищены от взлома. В 2019 году Gate.io подвергся громкому взлому, в результате которого было потеряно более 200 000 долларов криптоактивов, хотя примерно половина из них была позже восстановлена.

ворот качества: пройдут ли ваши проекты?

Примечание редактора: этот пост содержит устаревшую информацию.Вместо этого прочтите документацию по Quality Gates. Это уже не подмножество профилей качества (это всегда было немного неудобно), концепция предупреждений выросла и стала воротами качества.

Ворота качества можно рассматривать двумя разными способами. На практическом уровне они представляют собой наборы того, что когда-то называлось предупреждениями, а теперь известно просто как «условия». На абстрактном уровне они представляют собой логические вентили, объединяющие по И все условия в наборе, чтобы определить, может ли ваш проект пройти.

На первый взгляд может показаться, что это просто переименование и перетасовка интерфейса, но это нечто большее. Перемещение ворот из профилей означает, что вы можете применять ровно одни и те же критерии ко всем проектам на разных языках. Конечно, у вас была возможность сделать это раньше, настроив одинаковые оповещения в каждом профиле от языка к языку. Но это был утомительный, ручной и, следовательно, подверженный ошибкам процесс. Теперь вы можете настроить его один раз и применить к каждому проекту конкретно или установить свои любимые ворота по умолчанию.

В области ворот значения по умолчанию в основном работают так же, как и для профилей: все получает значение по умолчанию, если оно специально не назначено чему-то другому. Большая разница в том, что по умолчанию нет ворот качества по умолчанию. (Еще не запутался?) Я имею в виду, что из коробки каждый язык имеет профиль по умолчанию. Это необходимо для того, чтобы вся установка работала. Но для того, чтобы анализ работал сразу после установки, шлюз качества не требуется, поэтому при первоначальном запуске нет шлюза качества по умолчанию.

SonarQube 4.3 поставляется с готовым гейтом (это то, что мы используем внутри), и вы можете легко сделать его гейтом по умолчанию, но мы не сделали этого за вас. Отчасти потому, что вы, вероятно, захотите, чтобы один из ваших собственных ворот качества использовался по умолчанию. Процесс миграции базы данных перемещает оповещения из каждого профиля в новый шлюз качества, названный в соответствии с профилем и языком, из которого они были получены.

Таким образом, после обновления вы захотите выбрать ворота по умолчанию и назначить любые проекты, которые не должны получить значения по умолчанию, к их конкретным воротам.

Как только вы начнете использовать врата 4.3, вы заметите несколько визуальных отличий. Значки были обновлены, а формулировка в переименованном виджете «Сводка показателей качества» немного отличается:

В остальном опыт почти такой же, как и был, с выделением метрик, которые сохраняются. ваш проект от чистого прохождения через ворота:

Это почти все, что вам нужно знать о качественных воротах. Они пропускают хорошие проекты и блокируют плохие.Остается только один вопрос: пройдут ли ваши проекты?

Внеклеточные ворота формируют энергетический профиль экспортера ABC

Abstract

Экспортеры ABC используют энергию АТФ для перекачивания субстратов через мембраны. Открытие и закрытие внеклеточных ворот являются ключевыми этапами транспортного цикла, но основной механизм плохо изучен. Здесь мы создали синтетическое однодоменное антитело (sybody), которое распознает гетеродимерный экспортер ABC TM287/288 исключительно в присутствии АТФ, что было необходимо для решения проблемы 3.2 Å кристаллическая структура обращенного наружу переносчика. sybody связывается с внеклеточным крылом и сильно ингибирует активность АТФазы, сдвигая конформационное равновесие транспортера в сторону обращенного наружу состояния, как показано с помощью двойного электрон-электронного резонанса (DEER). Мутации, которые облегчают открытие внеклеточных ворот, приводят к сравнимому сдвигу равновесия и сильно снижают активность АТФазы и транспорт лекарств. Используя sybody в качестве конформационного зонда, мы демонстрируем, что эффективное закрытие внеклеточных ворот необходимо для диссоциации димера NBD после гидролиза АТФ, чтобы вернуть транспортер обратно в его обращенное внутрь состояние.

Тематические термины: Биохимия, Структурная биология

Введение

Экспортеры ABC представляют собой универсальные мембранные белки, обнаруженные во всех типах жизни. Экспортеры типа I являются наиболее изученным классом экспортеров ABC и состоят как минимум из двух трансмембранных доменов (TMD), каждый из которых включает шесть трансмембранных спиралей и два домена связывания нуклеотидов (NBD), которые универсально консервативны среди всех транспортеров ABC. NBD претерпевают большие конформационные изменения в ответ на связывание и гидролиз АТФ, которые передаются в TMD через спирали связывания, чтобы принять конформацию, обращенную внутрь (IF), обращенную наружу (OF) и закрытую наружу (Occ) конформацию 1 .Чередующийся доступ к TMDs в сочетании с изменениями аффинности по отношению к транспортируемым субстратам делает возможным восходящий транспорт через липидный бислой 2 . Полностью закрытые NBD стабилизируются двумя молекулами АТФ, связанными на поверхности димера, и совпадают с TMD, принимающими состояние OF или Occ 3 , 4 . Переход в состояние IF требует, чтобы NBD разделились, по крайней мере, до некоторой степени, процесс, который инициируется гидролизом АТФ 5 .

Многие экспортеры ABC, включая все семейство ABCC человека, имеют асимметричные сайты связывания АТФ, а именно вырожденный сайт, который может связывать, но не гидролизовать АТФ, и консенсусный сайт, который способен к гидролизу 6 . Гетеродимер ТМ287/288 термофильной бактерии Thermotoga maritima был первым структурно проанализированным примером АВС-экспортера с вырожденным сайтом 7 , 8 . Две близкородственные структуры IF TM287/288 были решены с помощью рентгеновской кристаллографии, либо они содержали одну молекулу AMP-PNP, связанную с вырожденным участком, либо не содержали нуклеотида.В отличие от большинства других структур IF экспортеров ABC, открытые NBD TM287/288 лишь частично разделены из-за контактов, опосредованных D-петлей вырожденного сайта, тогда как D-петля консенсусного сайта аллостерически связывает связывание АТФ в вырожденный сайт к гидролизу АТФ в консенсусном сайте 8 . Консенсусный сайт имеет искажения в мотиве Walker B, что предотвращает связывание нуклеотидов в транспортере IF 7 . Исследования DEER показали, что TM287/288 демонстрирует динамическое равновесие IF/OF в присутствии нуклеотидов и что захват нуклеотидов в консенсусном сайте необходим для сильного заселения состояния OF, тогда как в присутствии AMP-PNP транспортер преимущественно принимает свою IF. штат 9 .

Распределение на большие расстояния было обнаружено DEER во внеклеточных воротах TM287/288, что указывает на конформационную гибкость в этой внешней области 9 . Аналогичные наблюдения были зарегистрированы для ABCB1 10 . Беспристрастное моделирование молекулярной динамики (МД) TM287/288 выявило спонтанные конформационные переходы из состояния IF через промежуточное соединение Occ в состояние OF 11 . Многие симуляции оставались в ловушке в состоянии Occ, указывая на то, что открытие внеклеточных ворот представляет собой главный энергетический барьер в конформационном цикле.Интересно, что степень открывания внеклеточных ворот сильно различается у различных экспортеров ABC типа I, определяемых в состояниях OF, тогда как ворота остаются закрытыми в состоянии Occ 3 , 4 , 12 . Следовательно, события, происходящие во внеклеточных воротах, вероятно, играют ключевую роль в транспорте субстрата и должны быть аллостерически связаны с каталитическим циклом NBD. Тем не менее, лежащий в основе молекулярный механизм неизвестен.

В этой работе мы создали однодоменные антитела, которые связываются исключительно с OF TM287/288 и тем самым ингибируют транспортный цикл.Связующие были инструментальными для решения кристаллической структуры транспортера в его состоянии OF и использовались для исследования молекулярных событий во внеклеточных воротах и ​​их аллостерической связи с NBD.

Результаты

Конформационное улавливание TM287/288

Решив две близкородственные IF-структуры TM287/288, наша цель состояла в том, чтобы получить атомную структуру этого гетеродимерного ABC-экспортера в его состоянии OF. Анализ DEER показал, что TM287/288, несущий мутацию TM288 E517Q в мотиве Walker B консенсусного сайта (мутация EtoQ), был почти полностью захвачен в состоянии OF в присутствии ATP-Mg или ATPγS-Mg 9 .Чтобы еще больше снизить остаточную АТФазную активность мутанта EtoQ (оборот 0,02 мин -1 ) в 6,5 раза, вместо этого мы ввели мутацию EtoA. Кроме того, мы создали однодоменные антитела (нанотела), которые распознают исключительно состояние OF TM287/288. С этой целью альпаки иммунизировали OF TM287/288, содержащим мотив сшитого тетраспирального пучка 13 (см. Методы). Этот подход привел к связыванию нанотела Nb_TM#1 исключительно с TM287/288 в присутствии (но не в отсутствие) АТФ, как показано с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (рис.). Однако кристаллы, полученные с Nb_TM#1, дифрагировали недостаточно хорошо, чтобы построить достоверную модель. Поэтому мы выбрали синтетические нанотела (ситела) против TM287/288(EtoA) в присутствии АТФ-Mg полностью in vitro 14 . Таким образом, было создано более десяти OF-специфических sybody, и sybody Sb_TM # 35 было успешно использовано для определения структуры OF TM287/288 (EtoA) в присутствии ATPγS-Mg с разрешением 3,2 Å (рис., дополнительная таблица 1). ).

Три обращенные наружу структуры TM287/288 в комплексе с фрагментами однодоменных антител.Транспортеры просматриваются вдоль плоскости мембраны (обозначены серым прямоугольником). a 3,2 Å структура TM287/288 (EtoA) в комплексе с ATPγS-Mg и специфичным для состояния sybody Sb_TM#35. b 3,5 Å структура TM287/288(2xDtoA/EtoA) в комплексе с ATPγS-Mg и нанотелом Nb_TM#1, зависящим от состояния. c 4,2 Å кристаллическая структура TM287/288 (2xDtoA/EtoA) в комплексе с ATPγS-Mg и нанотелом Nb_TM#2, не зависящим от состояния. d SPR-анализы в отсутствие (верхняя панель) и в присутствии (нижняя панель) АТФ с использованием иммобилизованного TM287/288 (EtoQ) в качестве лиганда и Sb_TM#35, Nb_TM#1 и Nb_TM#2 в качестве аналитов.Вводимые концентрации Sb_TM#35: 0, 9, 27, 81, 243, 729 нМ; Nb_TM#1: 0, 1, 3, 9, 27, 81 нМ; Nb_TM#2: 0, 0,9, 2,7, 8,1, 24,3, 72,9 нМ. Кинетический анализ показан в дополнительной таблице 2

Структура комплекса TM287/288-sybody

Sybody Sb_TM#35 связывается на вершине внеклеточного крыла TM287/288 (рис. ) и играет решающую роль в установлении контактов с кристаллами ( Дополнительный рис. 1 ). Связывание опосредуется ароматическими остатками всех трех областей, определяющих комплементарность (CDR) sybody, которые зажаты между трансмембранными спиралями (TM) 1 и 2 TM287 и TM 5′ и 6′ TM288 (фиг.). Поскольку Sb_TM#35 связывается только в присутствии АТФ (рис. ), мы предположили, что он мешает каталитическому циклу переносчика. Действительно, sybody ингибировал АТФазную активность TM287/288 в детергенте (IC 50 66,1 нМ, рис. ), а также восстанавливался в нанодисках (дополнительный рисунок  2b ). Следует отметить, что ингибирование было менее эффективным в нанодисках, предположительно из-за нарушения доступности эпитопов sybody в контексте мембраны.

sybody перехватывает TM287/288 в состоянии OF. a Sybody Sb_TM#35 показан серым цветом, а CDR1, 2 и 3 выделены желтым, оранжевым и красным цветом соответственно. Четыре ароматических остатка (Y33, W52, Y59 и W113), которые вклиниваются между TM 1 и 2 TM287 (бирюзовый) и TM 5′ и 6′ TM288 (пурпурный), выделены палочками. b Ингибирование гидролиза АТФ TM287/288 с помощью Sb_TM#35, Nb_TM#1 и Nb_TM#2. Нерандомизированное тело служило контролем. Данные были сопоставлены с гиперболической функцией затухания для определения значений IC 50 , а также остаточной активности.Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения технических троек. c , d DEER-анализ пар спин-меток, введенных для исследования внеклеточных и внутриклеточных TMD и NBD ( c ), а также связывания sybody с транспортером ( d ). Следы DEER регистрировали в присутствии АТФ-ЭДТА с немеченым Sb_TM#35 или без него ( c ) или в присутствии АТФ-ЭДТА и спин-меченого Sb_TM#35 ( d ). На графиках показано экспериментальное распределение расстояний, а вертикальные пунктирные линии, показанные в c  , показывают изменения средних расстояний

Два нанотела, адресующие эпитопы на NBD

Использование структуры высокого разрешения OF TM287/288 для молекулярной замены и в качестве шаблона для при построении модели мы решили две дополнительные структуры с низким разрешением (3.5–4,2 Å) транспортера ОФ, определенного в комплексе с нанотелами альпаки Nb_TM#1 и Nb_TM#2 (рис. ). Nb_TM#1 специфически распознает состояние OF и связывается с нижней частью закрытого димера NBD, занимая эпитоп, общий для NBD287 и NBD288 (рис. ). Было обнаружено, что сродни Sb_TM # 35, Nb_TM # 1, специфичный для состояния, ингибирует АТФазную активность транспортера (рис. ). Nb_TM#2 связывается сбоку с NBD288 и проявляет пикомолярное сродство к транспортеру независимо от того, присутствует АТФ или нет (рис., Дополнительная таблица 2 ). Тем не менее, это нанотело частично ингибирует активность АТФазы примерно на 30% уже при самой низкой исследованной концентрации 20 нМ (рис. ). Поскольку концентрация TM287/288 должна была составлять не менее 8 нМ для надежного измерения активности АТФазы, мы не смогли определить значение IC 50 для Nb_TM#2. Артефакт измерения можно исключить, поскольку неродственное контрольное тело не влияло на АТФазную активность транспортера (рис. ).

Переход от IF к OF делает TM287/288 более симметричным

Структура OF TM287/288 включает полностью димеризованные NBD, которые образуют сэндвич между двумя молекулами ATPγS-Mg в вырожденном и консенсусном сайтах (рис., Дополнительный рис. 3 ). Почти идентичная структура (RMSD 0,21 Å) была также получена в присутствии АТФ-Mg (дополнительный рисунок 4c , дополнительная таблица 1 ). В отличие от NBD IF TM287/288, которые демонстрировали выраженную асимметрию между вырожденным и консенсусным сайтом, в основном в отношении D-петлей 8 , закрытый димер NBD транспортера OF более симметричен (рис. , Дополнительный рис. 3 ). Кроме того, искажения, обнаруженные в каталитической диаде консенсусного сайта структуры IF (E517 TM288 и H548 TM288 ), релаксируют во время перехода в состояние OF, и два ключевых остатка принимают расположение, способное к гидролизу (рис.). Интересно, что в консенсусном сайте присутствуют два туннеля, которые позволили бы высвобождать расщепленный γ-фосфат (рис. ). TMD, состоящие из двух крыльев, каждое из которых включает шесть трансмембранных спиралей, полученных от обоих протомеров, широко открыты наружу (дополнительный рисунок 4 ). При среднеквадратичном отклонении 1,73 Å структура TM287/288 больше всего напоминает структуру Sav1866. Кроме того, структура OF аналогична конформации OF TM287/288, предсказанной моделированием MD (дополнительный рис. 5 ) 11 , хотя в МД-моделировании белок был встроен в липидный бислой вместо детергентной среды, используемой для кристаллизации. Также степень закрытия NBD и открытия внеклеточных ворот очень похожа между TM287/288 и Sav1866 (дополнительный рисунок 6a ). СКО между TM287 и TM288 уменьшается с 2,55 Å до 1,98 Å по мере того, как транспортер преобразуется из конформации IF в OF, что указывает на то, что OF TM287/288 более симметричен (дополнительный рис.). В то время как аналогичная степень симметрии наблюдалась между полутранспортерами OF ABCB1 (PDB: 6C0V, RMSD 2,07 Å), эквивалентные суперпозиции демонстрируют существенную асимметрию в структуре OF MRP1 (PDB: 6BHU, RMSD 4,54 Å), в основном из-за асимметрии TMD (дополнительный рисунок 6b ). Открытие внеклеточных ворот менее выражено в MRP1 и еще менее выражено в ABCB1, и ворота остаются почти полностью закрытыми в окклюзированной наружу структуре McjD 4 (дополнительный рис.). Следовательно, структуры экспортеров OF и Occ ABC демонстрируют наибольшую структурную изменчивость во внеклеточных воротах.

Структурный анализ закрытого димера NBD. a Полностью закрытый димер NBD (NBD287 бирюзового цвета и NBD288 пурпурного цвета) помещает две молекулы ATPγS-Mg (показаны в виде палочек с соответствующей электронной плотностью) между мотивом Walker A (красный) и противоположным мотивом сигнатуры ABC (зеленый) в конце вырождены, а консенсусный сайт высокосимметричен.Остатки, участвующие в связывании и гидролизе АТФ, показаны палочками. b Наложение согласованного сайта связывания АТФ ранее решенной структуры IF (PDB: 4Q4A, светло-розовый) и структуры OF (пурпурный). Искажения каталитической диады (E517 TM288 и H548 TM288 ) ослабляются во время закрытия NBD, чтобы принять компетенцию гидролиза. Боковая цепь E517 TM288 была смоделирована в структуру TM287/288 (EtoA). c Срез двух сайтов связывания нуклеотидов показывает два возможных выходных туннеля P и в консенсусном сайте, которых нет в вырожденном сайте.ATPγS (частично вырезанный) показан в виде желтых палочек

sybody действует как молекулярный зажим

Интересно, что мы не обнаружили стерических столкновений, которые препятствовали бы связыванию Sb_TM#35 с транспортером IF. Следовательно, основываясь только на структурной информации, мы не могли объяснить, почему sybody ингибирует активность АТФазы. Поэтому мы использовали спектроскопию DEER, чтобы выяснить влияние тела на конформационный цикл.

Было обнаружено, что sybody смещает равновесие транспортера в сторону состояния OF, что измеряется в присутствии АТФ-ЭДТА (стрелки на рис.). Выраженные эффекты наблюдались во внеклеточной области (54 TM287 /290 TM288 и 54 TM287 /271 TM287 ), а также при зондировании на расстоянии во внутриклеточной области ВНЧС (131 2 800862 02 TM288 ) и в NBD (460 TM287 /363 TM288 ) (рис. и дополнительный рисунок ). Кроме того, мы наблюдали увеличение расстояния между двумя спиновыми метками, расположенными в крыле под телом (54 TM287 /290 TM288 ) в результате связывания тела (пунктирные вертикальные линии на рис.). Это говорит о том, что sybody действует как клин при раскрытом внеклеточном крыле. Как и ожидалось из-за отсутствия связывания sybody с состоянием IF, мы наблюдали незначительное влияние на межспиновые расстояния, когда TM287/288 инкубировали с sybody в отсутствие нуклеотидов (состояние апо) (дополнительный рисунок 7 ).

Чтобы исследовать расположение связанного sybody относительно противоположного крыла, мы затем сосредоточились на расстоянии между sybody, помеченным в позиции 71, и спиновыми метками, введенными либо в 54 TM287 (крыло, связывающее sybody), либо в 271 TM287. (противоположное крыло) транспортера (рис.и дополнительный рисунок 8 ). Основной пик расстояния, соответствующий дипольному взаимодействию между 71 Sb_TM#35 и 54 TM287 , был очень острым и с центром на 3,8 нм, в то время как он был несколько шире и с центром на 3,2 нм между 71 Sb_TM#35 и 271 TM28062. разместили на противоположном крыле. Оба расстояния были видны только в присутствии АТФ и хорошо согласовывались с моделированием, основанным на структуре OF (дополнительный рисунок 8 ).Обе кривые также содержали пик расстояния около 5,2 нм, соответствующий остаточной доле димеров sybody в растворе. В заключение, sybody действует как молекулярный зажим, удерживающий внеклеточные ворота открытыми.

Законсервированные аспартаты запечатывают внеклеточные ворота

Показав, что sybody захватывает транспортер в полностью открытом состоянии, мы пришли к выводу, что мутации, способствующие открытию внеклеточных ворот, будут иметь аналогичное влияние на энергетический ландшафт транспортера.В ИФ TM287/288, D41 TM287 и D65 TM288 , помещенные в TM1 соответствующего полутранспортера, устанавливаются водородные связи с амидами основной цепи противоположного крыла (рис. ). Следует отметить, что эти аспартаты сохраняются у бактериальных экспортеров ABC (рис. ), но не у эукариотических членов семейства. Когда аспартаты были заменены аланинами, АТФазная активность TM287/288 снизилась примерно в три раза для одиночных мутантов и примерно в 10 раз для двойных мутантов (далее называемых мутантами 2xDtoA) (рис.).

Внеклеточные ворота закрыты двумя законсервированными аспартатами. a Структура внеклеточных ворот TM287/288 в состоянии IF (слева, PDB: 4Q4H) и OF (справа), показанная на рисунке. D41 TM287 и D65 TM288 показаны в виде палочек и устанавливают водородные связи (желтые пунктирные линии) с пептидным остовом (показаны в виде палочек) соседних спиралей TM6 и TM6′, которые разрываются во время перехода IF-OF. b Выравнивание последовательностей бактериальных экспортеров ABC в области, содержащей консервативные аспартаты внеклеточных ворот. c АТФазная активность одиночных мутантов D41A TM287 и D65A TM288 и соответствующих двойных мутантов (2xDtoA) по сравнению с TM287/288 дикого типа определена в детергенте. d Стимулируемая лекарственным средством АТФазная активность EfrEF дикого типа, одиночных мутантов D41A EfrE и D50A EfrF и соответствующих двойных мутантов (2xDtoA), восстановленных в протеолипосомы, определенная в отсутствие (базовая активность) или в присутствии этидия в указанных концентрациях.Данные нормализовали к базовой АТФазной активности соответствующего мутанта. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения технических троек. e Накопление этидия в клетках Lactococcus lactis , экспрессирующих EfrEF дикого типа, неактивный мутант Walker B E515Q EfrF или внеклеточные гейт-мутанты D41A EfrE и D50A EfrF или соответствующий двойной DxDxмутант . f DEER анализирует внеклеточные и внутриклеточные TMD и NBD (те же позиции, что и на рис.). Следы DEER регистрировали в присутствии АТФ-ЭДТА для транспортера дикого типа и для TM287/288 (2xDtoA). г Относительная АТФазная активность мутанта 2xDtoA в присутствии возрастающих концентраций Sb_TM#35, Nb_TM#1 и Nb_TM#2. Нерандомизированное тело служило контролем. Данные были сопоставлены с гиперболической функцией затухания для определения значений IC 50 , а также остаточной активности. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения технических трех повторов

Снова используя АТФ-ЭДТА для индуцирования перехода IF в OF, анализ DEER выявил сдвиг равновесия в сторону состояния OF в мутанте 2xDtoA для всех спин-меченых пар (рис.и дополнительный рисунок 9 ). Сдвиг равновесия был аналогичен сдвигу, вызванному Sb_TM#35. Следовательно, аспартаты во внеклеточных воротах представляют собой энергетический барьер, который необходимо преодолеть, чтобы переключиться в состояние OF и повлиять на АТФазный цикл в дальнодействующей аллостерической связи, соединяющей внеклеточные ворота с NBD.

Чтобы изучить атомные детали конформационной динамики, лежащей в основе перехода IF-OF, мы выполнили МД-моделирование TM287/288 в липидном бислое POPC, начиная с кристаллической структуры IF (PDB: 4Q4A), после стыковки второго ATP-Mg молекулы в консенсусный сайт 11 и введение мутаций 2xDtoA во внеклеточные ворота.Как и в наших предыдущих MD-симуляциях TM дикого типа 287/288 11 , мы наблюдали спонтанные крупномасштабные конформационные переходы от конформации IF через состояние Occ к конформации OF; этот полный переход наблюдался в 3 из 20 независимых симуляций 500 нс (дополнительный рисунок 10 ). Несмотря на ограниченную статистику, переход происходит несколько чаще, чем у дикого типа (6 из 100 симуляций 11 ), что согласуется с нашими экспериментальными результатами и представлением о том, что полярные контакты двух остатков аспартата повышают энергетический барьер открытия внеклеточных ворот.Хотя МД-моделирование и экспериментальные данные согласуются, мы не можем исключить различные результаты, если эти довольно продолжительные моделирования проводились в липидном бислое, содержащем другие липиды, такие как, например, POPE 15 . Чтобы оценить стабильность структуры OF, о которой сообщается в этой работе, было проведено 20 независимых 400-нс симуляций как для дикого типа, так и для мутанта 2xDtoA. Хотя sybody не присутствует в моделировании, конформация OF с двумя связанными молекулами АТФ-Mg очень стабильна и просто колеблется вокруг рентгеновской структуры (дополнительный рис. 11 ). Дополнительное контрольное моделирование в бислое POPE (вместо POPC) подтвердило этот результат (дополнительный рисунок 11 ), что делает маловероятным то, что состав липидов (с точки зрения головных групп PC и PE) оказывает большое влияние на АТФ-Mg. -связанная структура OF.

Затем мы ввели мутации 2xDtoA в гетеродимерный экспортер ABC EfrEF Enterococcus faecalis (рис.) 16 . Было обнаружено, что стимулированные этидием профили АТФазной активности восстановленного мембраной EfrEF сильно зависят от одиночных мутаций DtoA, и АТФазная активность EfrEF, содержащего мутации 2xDtoA, больше не может стимулироваться лекарственным средством (рис.). Подтверждая это мнение, мутант TM287/288 (2xDtoA), восстановленный в нанодисках, демонстрировал сильно сниженную стимуляцию лекарственными средствами Hoechst 33342 (дополнительный рисунок 2a ). Затем мы экспрессировали мутанты EfrEF дикого типа и DtoA в Lactococcus lactis и отслеживали поглощение этидия с помощью измерений флуоресценции (рис. ). EfrEF дикого типа эффективно вытесняет этидий из клетки, что приводит к медленному увеличению накопления этидия, которое достигает низкого стационарного уровня. EfrEF, содержащий мутацию EtoQ в NBD, служил в качестве отрицательного контроля, демонстрируя высокие уровни накопления этидия 17 .Одиночные мутанты DtoA D41A EfrE и D50A EfrF частично утратили способность к оттоку этидия. Интересно, что кривая накопления мутанта 2xDtoA не достигает стационарного уровня в пределах временных рамок эксперимента. Это наблюдение предполагает дефект транспортера, приводящий к пассивному притоку этидия в клетку, опосредованному EfrEF, несущему мутации 2xDtoA. В заключение, внеклеточные аспартаты являются важными остатками-привратниками, которые аллостерически связаны с NBD и необходимы для транспорта субстрата.

Внеклеточный гейт-мутант и sybody синергичны

Поскольку как связывание sybody, так и ослабление внеклеточного гейта сдвигают конформационное равновесие в сторону состояния OF, мы пришли к выводу, что эти эффекты являются аддитивными. Действительно, при IC 50 18,4 нМ (рис. ) ингибирование TM287/288, несущего мутации 2xDtoA, с помощью Sb_TM#35 оказалось более выраженным, чем ингибирование транспортера дикого типа (IC 50  = 66,1 нМ) (рис. ). Кроме того, сродство Sb_TM#35 к мутанту 2xDtoA ( K D  = 14 нМ) было примерно в восемь раз выше, чем к транспортеру дикого типа ( K D  = 110 nM) Инжир. 12 , дополнительная таблица 2 ). Аффинность также увеличивалась при введении мутации EtoA или EtoQ в консенсусный сайт транспортера ( K D  = 66 нМ), который также демонстрировал сдвиг конформационного равновесия в сторону состояния OF 9 и был самый высокий для комбинированного тройного мутанта (2xDtoA/EtoA) ( K D  = 8 нМ). Аналогичная картина наблюдалась для Nb_TM#1, который связывается с закрытым димером NBD.IC 50 была значительно меньше при исследовании мутанта 2xDtoA ( K D  = 16,8 нМ) по сравнению с TM287/288 дикого типа ( K D  0=  (рис. 6,  0) . Это различие снова отражалось увеличением аффинности для мутанта 2xDtoA (37 нМ) по сравнению с транспортером дикого типа ( K D  = 184 нМ), а самая высокая аффинность наблюдалась для тройного мутанта ( K D  = 5 нМ) (дополнительный рисунок 12 , дополнительная таблица 2 ).В заключение, Sb_TM#35 и Nb_TM#1 связываются с противоположными концами транспортера, но, тем не менее, демонстрируют очень сходное биофизическое поведение при захвате транспортера OF.

Исследование преобразования OF-IF с помощью связывающих веществ, специфичных для состояния

Наконец, мы проверили, могут ли нанотела, зависящие от состояния, использоваться в качестве зондов в SPR для исследования перехода OF-IF TM287/288. Когда иммобилизованный TM287/288 (EtoA) заряжали АТФ-Mg и затем промывали буфером, не содержащим нуклеотидов, максимальный сигнал связывания SPR для связывающих веществ, специфичных для состояния OF, Sb_TM#35 и Nb_TM#1 медленно уменьшался в течение временного окна в несколько часов (рис.). Иммобилизованный TM287/288 был стабилен в течение этого времени, потому что максимальный сигнал связывания для неспецифического по состоянию нанотела Nb_TM#2 лишь незначительно уменьшился (рис. ). Впоследствии мы исследовали конверсию OF-IF с использованием либо АТФ-Mg (гидролизующие условия), либо АТФ-ЭДТА (связывание АТФ без гидролиза).

Проверка перехода OF-IF с помощью связывателей, зависящих от состояния. a Примеры необработанных данных следов SPR, на основе которых было обнаружено конформационное зондирование. В нулевой момент времени иммобилизованный TM287/288 (EtoA) заряжали 1 мМ АТФ (красная стрелка) и вводили связующие вещества (серые стрелки) в насыщающих концентрациях (Sb_TM#35, 1 мкМ; Nb_TM#1, 500 нМ; Nb_TM# 2, 100 нМ) для получения максимальных значений единиц ответа (RU max ) в указанные моменты времени. b RU max значения для дикого типа и мутантных TM287/288 были получены, как показано в a , путем зарядки транспортера 1  мМ АТФ либо в присутствии Mg 2+ (верхняя панель), либо ЭДТА (нижняя панель). панель). Для связующих веществ Sb_TM#35 и Nb_TM#1, зависящих от состояния, данные были подобраны с использованием функции однофазного распада для определения значений периода полураспада ( t 1/2 ) состояния OF. Nb_TM#2, не зависящий от состояния, использовали в качестве контроля. эксперимент, показывающий быстрое преобразование в состояние IF.Напротив, состояние OF было долгоживущим, когда ATP-Mg окклюзировался EtoQ или мутантом EtoA. Время жизни в состоянии OF, определяемое специфическими для состояния связующими веществами Sb_TM#35 или Nb_TM#1, было очень сходным ( t 1/2 из 45 или 49 минут для мутанта EtoQ и 287 или 268 минут для EtoA). мутант соответственно). Поразительно, но эти значения хорошо согласуются с периодом полураспада АТФ, гидролизованного этими мутантами, а именно 32 мин (мутант EtoQ) и 205 мин (мутант EtoA) при 25°C. Для тех же мутантов ситуация была обратной для АТФ-ЭДТА.Мутант EtoA легко превращался в состояние IF, аналогичное транспортеру дикого типа, тогда как состояние OF было очень стабильным для мутанта EtoQ ( t 1/2  = 112 или 95 мин соответственно). В этом случае АТФ не может гидролизоваться, и мы исследуем диссоциацию NBD со связанной АТФ (но без координации Mg 2+ ). Глутамин в мотиве Walker B, по-видимому, стабилизирует связывание АТФ в сэндвич-димере NBD, тогда как канонический глутамат или аланин в том же положении способствуют быстрой диссоциации NBD.При введении мутаций 2xDtoA состояние OF было очень долгоживущим в случае АТФ-ЭДТА ( t 1/2  = 297 или 281 мин соответственно). Это говорит о том, что ослабление внеклеточных ворот мутациями 2xDtoA сильно препятствует диссоциации NBD, тогда как диссоциация NBD транспортера дикого типа в этих экспериментальных условиях происходит очень быстро. Открытие NBD еще больше замедляется, если мутации 2xDtoA сочетаются с мутацией EtoA как для АТФ-Mg, так и для АТФ-ЭДТА.

Из этого набора данных можно сделать два основных вывода. Во-первых, гидролиз АТФ ослабляет димер NBD и необходим для сброса транспортера в состояние IF в физиологических условиях, где всегда присутствуют АТФ и Mg 2+ . И, во-вторых, сильные контакты на внеклеточных воротах необходимы для оказания механической силы на NBD, чтобы облегчить быстрое открытие NBD, чтобы сбросить транспорт обратно в его IF-состояние.

Обсуждение

В этой работе мы раскрыли возможности однодоменных антител, специфичных для состояния, полученных от альпак и полностью in vitro из синтетических библиотек, для исследования мембранного переносчика на структурном и функциональном уровне.Стратегия создания специфических для штата биндеров против экспортеров ABC типа I имеет долгую историю, уходящую в 90-е годы прошлого века, когда было идентифицировано специфическое для штата ABCB1 антитело UIC2 18 . Недавняя крио-ЭМ структура ABCB1 в комплексе с UIC2 выявила, что антитело зажимает внеклеточные петли вместе, тем самым предотвращая открытие внеклеточных ворот 19 . Молекулярный зажим закрытых внеклеточных ворот был также достигнут с помощью циклического пептида, индуцированного против CmABCB1 20 .Другими примерами связующих, которые предотвращают превращение IF-OF, являются нанотела, образующиеся против ABCB1 и PglK, которые оба стерически конфликтуют с закрытием NBD , , 21, , , 22, , . Напротив, наши связующие специфичны для состояния OF и, следовательно, препятствуют превращению OF-IF.

Связывание Sybody с внеклеточным крылом TM287/288 было необходимо для решения структуры OF. И вырожденный, и консенсусный сайт связывания АТФ полностью закрыты и высокосимметричны, но только консенсусный сайт несет каталитическую диаду, расположенную для катализа гидролиза АТФ 23 .Это говорит о том, что гидролиза АТФ только одного нуклеотида достаточно, чтобы инициировать диссоциацию NBD. В подтверждение этой точки зрения закрытые димеры NBD имеют два возможных выходных туннеля P и в консенсусном сайте.

Сравнение с другими транспортными структурами OF и Occ выявило большую конформационную гетерогенность в степени открытия внеклеточных ворот, которая, как обсуждалось, играет потенциальную роль в выдавливании субстратов или предотвращении повторного связывания субстратов 3 , 4 , 10 , 12 , 24 .В этом исследовании мы раскрываем перекрестные помехи между внеклеточными воротами и циклом АТФазы, связь, которая, насколько нам известно, еще не исследована на молекулярном уровне (рис. ). sybody, стабилизирующий открытое внеклеточное крыло, или мутации, ослабляющие внеклеточные ворота, смещают конформационное равновесие в сторону состояния OF. Предыдущие экспериментальные и вычислительные исследования показали, что закрытие NBD предшествует открытию внеклеточных ворот во время перехода IF-OF 11 , 25 , а анализ DEER показал, что открытие внеклеточных ворот может быть частичным, когда NBD закрывается полностью 9 , 10 , 26 .Следовательно, по-видимому, существует встроенный механический принцип, согласно которому открытие внеклеточных ворот требует больших энергетических затрат. И наоборот, используя наши нанотела, зависящие от состояния, в качестве конформационных зондов, мы смогли показать, что закрытие внеклеточных ворот связано с диссоциацией закрытого димера NBD после гидролиза АТФ. Наши эксперименты с EfrEF продемонстрировали, что плотно закрытые внеклеточные ворота на самом деле имеют решающее значение для функции транспортера. Кроме того, мутант 2xDtoA имел сильно сниженную активность АТФазы и утратил способность стимулироваться лекарственными препаратами.Это указывает на то, что закрытие внеклеточных ворот стало лимитирующей стадией каталитического цикла мутанта 2xDtoA. Следовательно, у этого мутанта превращение IF-OF больше не ограничивает скорость и, следовательно, не может стимулироваться связыванием лекарственного средства с направленным внутрь высокоаффинным сайтом (Fig. ).

Роль внеклеточных ворот в транспортном цикле TM287/288. Субстрат (желтая звезда) связывается с транспортером IF (1) с высокой аффинностью, в то время как внеклеточные ворота закрыты двумя аспартатами (закрытый D-замок).Связывание и окклюзия двух молекул АТФ-Mg на интерфейсе NBD приводит к переходу в состояние OF (2). Внеклеточные ворота открываются (открытый D-замок) и высвобождается субстрат. Внеклеточные ворота пустой обращенной наружу полости закрываются (3) и, таким образом, могут запускать гидролиз АТФ в консенсусном сайте. Механическая сила прочно закрытых внеклеточных ворот (закрытых D-замков) необходима для диссоциации NBD после гидролиза АТФ, чтобы вернуть транспортер в его состояние IF

Состояние OF, связанное с АТФ, с полностью закрытыми NBD упоминается как высокоэнергетическое состояние транспортного цикла, и в некоторых случаях предполагалось, что гидролиз АТФ необходим для заполнения состояния OF вообще 10 , 26 .Напротив, мы и другие ранее установили, что связывания АТФ достаточно для преобразования IF-OF и высвобождения субстрата 9 , 11 , 27 , в соответствии с моделью переключения АТФ 28 . Следует отметить, что в то время как открытые внеклеточные ворота действительно представляют высокоэнергетическое состояние, в действительности верно обратное для закрытого димера NBD. Он принимает низкоэнергетическое состояние, и для диссоциации димера 29 требуется большое количество энергии.Частично это достигается гидролизом АТФ 30 , 31 . Важно отметить, что наши результаты предполагают, что диссоциация NBD также включает механический компонент, опосредованный закрытием внеклеточных ворот. Еще одной возможностью является запуск гидролиза АТФ в результате закрытия внеклеточных ворот. Хотя это спекулятивно и напрямую не подтверждается и не исключается нашими данными, такой механизм гарантирует, что транспортер возвращается в состояние IF только после высвобождения субстрата.

Почему и когда гидролиз АТФ необходим для достижения активного транспорта, является постоянным предметом споров в области транспортеров ABC. Наши данные, представленные здесь и в предыдущих исследованиях 9 , 11 , ясно указывают на то, что только связывание АТФ (в случае АТФ-ЭДТА, когда гидролиз АТФ не может происходить) достаточно для конверсии IF-OF и, предположительно, для активного транспорта одна молекула субстрата. Затем направленность транспорта достигается за счет переключения аффинности сайта связывания субстрата, который неизбежно подвергается радикальным перестройкам, когда TMDs переключаются с IF на OF конформацию 12 .Тем не менее, маловероятно, что ABC-экспортер может эффективно работать только за счет связывания и диссоциации АТФ, потому что не хватает энергии, и молекулярные события будут управляться только медленными стохастическими броуновскими движениями. Чтобы сильно заселить состояние OF в физиологических условиях, ATP-Mg должен быть окклюзирован в консенсусном сайте закрытого димера NBD 32 , состояние, которое может быть эффективно имитировано мутацией Walker B EtoQ или EtoA 33 .Как мы показываем здесь с помощью наших зондов-биндеров, окклюзия АТФ прочно захватывает транспортер в состоянии OF и предотвращает цикличность транспортера. Следовательно, гидролиз АТФ, по-видимому, строго необходим для инициации диссоциации закрытого димера NBD. Как только АТФ гидролизуется, сила, создаваемая закрытыми внеклеточными воротами, облегчает диссоциацию NBD. Таким образом, наши результаты подтверждают представление о том, что гидролиз АТФ необходим для управления транспортным циклом на этапе сброса из состояния OF в состояние IF.

Мы надеемся, что наши результаты обеспечат механистическую основу для дальнейшего изучения функциональной роли внеклеточных ворот экспортеров ABC типа I и изучения молекулярной основы болезнетворных мутаций, обнаруженных во внеклеточной области важных с медицинской точки зрения экспортеров ABC, таких как MRP1. и CFTR 34 , 35 .

Методы

Экспрессия и очистка

Гены, кодирующие гетеродимерный транспортер ABC TM287/288, были амплифицированы и клонированы в pINIT_cat (addgene: Plasmid #46858) 7 . Гены были субклонированы. ; 36 для кристаллизации и биохимических анализов в вектор экспрессии pBXNh4L или в вектор экспрессии pBXNh4LCA для получения биотинилированных вариантов TM287/288 14 .

Свежетрансформированные клетки MC1061 E. coli выращивали в среде Terrific Broth (TB) с добавлением 100  мкг/мл ампициллина до OD 600 1,0–1,5 при 37 °C, а экспрессию индуцировали добавлением 0,0017 % (масса/объем) L-арабинозы в течение 5 часов при 30 °C. Собирали клетки и готовили клеточные мембраны в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 200 мМ NaCl и 10 % (об./об.) глицерина. Мембраны солюбилизировали добавлением 1% (мас./об.) н-додецил-β-D-мальтозида (β-DDM, Glycon) в течение 2 ч при 4°С.Солюбилизированные мембраны были дополнены 20 мМ имидазолом и загружены в самотечную колонку Ni-NTA Superflow (Qiagen) при 4°C, промыты 20 объемами колонки 50 мМ имидазола, pH 7,5, 200 мМ NaCl, 10 % (об./об.) глицерина. и 0,03 % (вес/объем) β-DDM или 0,3 % (вес/объем) н-децил-β-D-мальтозида (β-DM, Glycon) и элюировали 4 объемами колонки 200 мМ имидазола, рН 7,5, 200 мМ NaCl. , 10 % (об./об.) глицерина и 0,03 % (вес./об.) β-DDM или 0,3 % (вес./об.) β-DM с последующим обессоливанием с использованием колонки PD-10 (GE Healthcare, 17–0851–1 ) уравновешивают 20 мМ Tris-HCl pH7.5, 150 мМ NaCl и 0,03 % (масса/объем) β-DDM или 0,3 % (масса/объем) β-DM. Метку His 10 отщепляли в течение ночи при 4 °C с использованием 3 C протеазы (1:10 масс./масс.) с последующей повторной загрузкой на колонку Ni-NTA с гравитационным потоком, уравновешенную 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 150. мМ NaCl, 40 мМ имидазола и 0,03 % (масса/объем) β-ДДМ или 0,3 % (масса/объем) β-ДМ при 4°С. Обработанный TM287/288 очищали эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl и 0.03 % (мас./об.) β-ДДМ или 0,3 % (мас./об.) β-ДМ при 4 °C и концентрируют до желаемой концентрации с помощью концентратора Amicon Ultra-4 с отсечением по молекулярной массе (MWCO) 50 кДа. Очищенные варианты TM287/288 использовали сразу или мгновенно заморозили в жидком азоте и хранили при -80 °C.

Avi-меченые варианты TM287/288 были ферментативно биотинилированы с использованием BirA во время расщепления при 3 C в 20 мМ имидазола, pH 7,5, 200 мМ NaCl, 10 % (об./об.) глицерина, 10 мМ ацетата магния и 0,03 % (масс./об.) β-ДДМ и двукратный молярный избыток биотина.

EFREF Был амплифицирован из геномной ДНК Enterococcus Faecalis V583, клонировал в шаттл Vector PREXNH4 через FX Cloning 36 и субклон в вектор экспрессии PNZ8048NH4 через векторные магистральные клонирование Cloning (VBEX) 37 . Трансформированные Л. Лактис NZ9000 ΔLMRAΔLMRCD Клетки 38 38 были выращены в среде M17, дополненные 0,5% глюкозы и 5 мкг / мл хлорамфеникола к OD 600 из 1 при 30 ° С, а экспрессию индуцировали добавление низинсодержащего культурального супернатанта л.lactis NZ9700 в течение 4 ч (1:5000 [об./об.]). Собирали клетки и готовили мембраны в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 200 мМ NaCl и 10 % (об./об.) глицерина 16 . EfrEF очищали с использованием β-DDM таким же образом, как и TM287/288 (см. выше).

Нанотела/ситела были либо экспрессированы из pSb_init (добавочный ген: #110100) для биохимических экспериментов, либо субклонированы в pBXNPHM3 (дополнительный ген: #110099) путем клонирования FX для получения нанотел/сител без меток для кристаллизации и экспериментов DEER 14 , 36 .Очищенные нанотела и синтела хранили при температуре -80 °С.

Мутагенез

Для ослабления внеклеточных ворот два консервативных аспартата были заменены аланинами в различных вариантах TM287/288, что привело к TM287/288(2xDtoA). D41A TM287 вводили с помощью праймеров TM287_D41A_FW (GGC ACG TAT TGT CGC CGA AGG AAT CG C) и TM287_D41A_RV (GCG ATT CCT TCG GCG ACA ATA CGT GCC). D65A TM288 вводили с помощью праймеров TM288_D65A_FW (CAT AGG AAA AAC GAT CGC TGT TGT CTT CG) и TM288_D65A_RV (CGA AGA CAA CAG CGA TCG TTT TTC CTA TG).Чтобы сделать TM287/288 каталитически неактивным, E517A TM288 вводили в TM287/288 и TM287/288 дикого типа (2xDtoA) с использованием праймеров TM288_E517A_FW (CCT GAT ACT GGA CGC AGC CAC CAG CAA C) и TM288_E517A_RV (TM288_E517A_RV). GCT GGT GGC TGC GTC CAG TAT CAG G). Мутация D41A EfrE вводилась с помощью праймеров EfrE_D41A_FW (CAA GTT GAT TGC TGT GGG CAT CG) и EfrE_D41A_RV (CGA TGC CCA CAG CAA TCA ACT TG). D50A EfrF был создан с использованием праймеров EfrF_D50A_FW (CAA TCG GGA TTG CTA ACC TCT TAG AAG C) и EfrF_D50A_RV (GCT TCT AAG AGG TTA GCA ATC CCG ATT G).Для сшивания транспортера в пучке тетраспирали в состоянии OF L200C TM287 вводили в cys-less TM287/288 (описано в ссылке 7 ) с использованием праймеров TM287_L200C_FW (GAG AAA ATC TCT). GCG GTG TCA GGG TAG TGA G) и TM287_L200C_RV (CTC ACT ACC CTG ACA CCG CAG AGA TTT TCT C) и в сочетании с мутацией S224C TM288 с использованием праймеров TM288_S224C_FW (CAT AGA AGA AGA CAT CTG CGG CCT CAC TGT G) и TM288_S224C_RV (CAC AGT GAG GCC GCA GAT GTC TTC TTC TAT G).

Для спинового мечения sybody S71C вводили в Sb_TM#35 с использованием праймеров Sb_TM#35_S71C_FW (CAC GGT GTG CCT GGA CAA CG) и Sb_TM#35_S71C_RV (CGT TGT CCA GGC ACA CCG TG).

Для спин-мечения TM287/288 три новых цистеина были введены в TM287/288 без cys (для простоты называемые TM287/288 дикого типа). S271C TM287 был получен с использованием праймеров TM287_S271C_FW (CAG ATG GAG ATA GGA TGC ATC ATG GCA TAC) и TM287_S271C_RV (GTA TGC CAT GAT GCA TCC TAT CTC CAT CTG) в виде отдельного мутанта или в комбинации с K54C TM0647 , который был создан с использованием праймеров TM287_K54C_FW (CTT TTC TCT GGT TTT GTG TAC AGG GAT CCT CAT G) и TM287_K54C_RV (CAT GAG GAT CCC TGT ACA CAA AAC CAG AGA AAA G).K54C TM287 также был получен в виде отдельного мутанта или в комбинации с I290C TM288 , введенным с праймерами TM288_I290C_FW (CGC CTT GAA AGA CTG TAT CAC GGT GGG) и TM288_I290C_RV (CCC ACC GTG ATA CAG TCT TTC).

Все очищенные мутантные белки были проанализированы с помощью SEC и не отличались по профилю элюирования и выходу от транспортера дикого типа.

Кристаллизация

Для кристаллизации TM287/288(EtoA) или TM287/288(2xDtoA/EtoA) в комплексе с Sb_TM#35, свежеочищенный переносчик в 0.3% (мас./об.) β-DM концентрировали примерно до 12 мг/мл с использованием концентратора Amicon Ultra-4 (50 кДа MWCO) и добавляли очищенный Sb_TM#35 (хранящийся при –80 °C) в кратный молярный избыток (конечная концентрация комплекса 10 мг/мл). Комплексы предварительно инкубировали с 2,5 мМ аденозин 5′-(3-тиотрифосфатом) (ATPγS, Sigma, A1388) или 5 мМ АТФ, 3 мМ MgCl 2 в течение 5–6 дней при 20 °C (без этой стадии инкубации, кристаллы не дифрагировали с высоким разрешением), до этого кристаллы выращивали методом диффузии паров в сидячих каплях (соотношение белок/резервуар 1:1) при 20 °C.Кристаллы собирали из лунок, содержащих либо 0,1 М ацетата натрия, рН 4,6, 0,035 М NaCl и 11,5% (вес/объем) ПЭГ6000 (структура, связанная с АТФγS), либо 0,1 М ацетата натрия, рН 4,6, 0,025 М NaCl и 12% масса/объем) ПЭГ6000 (структура, связанная с АТФ). Кристаллы появлялись в течение 1–3 дней и сразу же вылавливались. Кристаллы подвергали криозащите в 0,1 М растворе ацетата натрия, рН 4,6, 0,04 М растворе NaCl и 15 % (масса/объем) ПЭГ6000, дополнительно содержащем 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,3 % (масса/объем) β-ДМ. , 3 мМ MgCl 2 , 1,25 мМ АТФγS или 5 мМ АТФ и 25% (об./об.) этиленгликоля и мгновенно заморожены в жидком азоте.

Для кристаллизации TM287/288(2xDtoA/EtoA) в комплексе с Nb_TM#1 очищенный Nb_TM#1 (хранящийся при –80 °C) добавляли к транспортеру, очищенному в 0,3% (вес/объем) β-ДМ в 1,2-кратный молярный избыток перед эксклюзионной хроматографией. После непродолжительной инкубации на льду комплекс отделяли от избытка нанотел эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,3% ж/об) β-ДМ. Комплексы транспортер/нанотело концентрировали до 10 мг/мл с использованием концентратора Amicon Ultra-4 (50 кДа MWCO) и инкубировали с 5 мМ ATPγS и 3 мМ MgCl 2 в течение 15 мин на льду.Кристаллы выращивали методом диффузии паров в сидячих каплях (соотношение белка и резервуара 1:1) при 20 °С в 0,05 М глицина, рН 9,5, 0,225 М NaCl и 21% (об./об.) ПЭГ550ММЭ. Кристаллы появлялись в течение 2–3 дней и выращивались еще 3 недели. Кристаллы подвергали криозащите в резервуарном растворе, содержащем 10% (об./об.) ПЭГ400, и мгновенно замораживали в жидком азоте.

Для кристаллизации TM287/288(2xDtoA/EtoA) в комплексе с Nb_TM#2 к транспортеру, очищенному в 0, добавляли очищенный Nb_TM#2 (хранился при -80 °C).03% (мас./об.) β-DDM в 1,2-кратном молярном избытке перед эксклюзионной хроматографией. После непродолжительной инкубации на льду комплекс отделяли от избытка нанотел эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,03% масса/объем) β-ДДМ. Комплексы транспортер/нанотело концентрировали до 10 мкг/мл с использованием концентратора Amicon Ultra-4 (50 кДа MWCO) и инкубировали с 2,5 мМ ATPγS и 3 мМ MgCl 2 в течение 15 мин на льду.Кристаллы выращивали методом диффузии паров в сидячих каплях (соотношение белка к резервуару 1:1) при 20 °С в 0,1 М трис-HCl, рН 8,5, 0,1 М NaCl и 30% (об./об.) ПЭГ400. Кристаллы появлялись в течение 2–3 дней и выращивались еще 2–3 недели. Кристаллы подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте без дополнительной криозащиты.

Сбор данных и определение структуры

Данные дифракции были собраны при длине волны 1,0 Å при 100 K на линиях пучка X06DA и X06SA в Swiss Light Source (SLS, Villigen, Швейцария).Данные дифракции были обработаны с помощью программы XDS 39 и усечены с использованием сервера анизотропии дифракции с настройками по умолчанию 40 из-за сильной или значительной анизотропии, что привело к улучшению карт электронной плотности (дополнительная таблица 1 , Рис. 13 ).

Структура комплекса TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 – ATPγS-Mg была решена путем молекулярной замены в Phaser 41 с использованием модифицированной модели гомологии на основе Sav1866 (PDB: 2HYD).Кристаллы относятся к пространственной группе P2 1 , содержащей два гетеродимера TM287/288 и два синтела на асимметричное звено. После нескольких циклов построения модели в Coot 42 и уточнения в Buster (www.globalalphasing.com) полиаланиновая модель нанотела (PDB: 1ZVH) была вручную помещена в дополнительную электронную плотность. Многочисленные итерации построения модели в Coot и уточнения TLS в Buster привели к получению окончательной модели с хорошей геометрией (рекомендуется Рамачандран/отклонения: 96.54%/0,08%) (дополнительная таблица 1 ). Цепи A (TM287), B (TM288) и E (Sb_TM#35) использовали для структурного анализа и фигур.

Для определения структуры комплекса TM287/288(2xDtoA/EtoA) – Sb_TM#35 – ATP-Mg окончательная структура комплекса TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 – ATPγS-Mg была использована для уточнения по сравнению с TM287/288(2xDtoA/EtoA) – Sb_TM#35 – данные АТФ-Mg. Были введены мутации 2xDtoA, и ATPγS был заменен на ATP в Coot. Уточнение TLS в Buster привело к получению окончательной модели с хорошей геометрией (рекомендуется Рамачандран/отклонения: 96.58%/0,24%) (дополнительная таблица 1 ). Цепи A (TM287) и B (TM288) использовали для структурного сравнения со структурой комплекса TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 – ATPγS-Mg.

Структура комплекса TM287/288(2xDtoA/EtoA) – Nb_TM#1 – ATPγS-Mg была решена методом молекулярной замены в Phaser с использованием структуры TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 без sybody. Кристаллы относятся к пространственной группе P2 1 , содержащей два гетеродимера TM287/288 и два нанотела на асимметричную единицу.После нескольких циклов построения модели в Coot и уточнения в Buster, Phaser был использован для размещения отсутствующего нанотела с использованием модели гомологии, основанной на записи PDB 5OCL. Несколько итераций построения модели в Coot и уточнение TLS в Buster привели к получению окончательной модели с хорошей геометрией (предпочтение/выбросы Рамачандрана: 94,68%/0,24%) (дополнительная таблица 1 ). Для фигур использовали цепи A (TM287), B (TM288) и E (Nb_TM#1).

Структура комплекса TM287/288(2xDtoA/EtoA) – Nb_TM#2 – ATPγS-Mg была решена методом молекулярной замены в Phaser с использованием структуры TM287/288(EtoA) – Sb_TM#35 без sybody.Кристаллы относятся к пространственной группе P1, содержащей два гетеродимера TM287/288 и два нанотела на асимметричную единицу. После нескольких циклов построения модели в Coot и уточнения в Buster, Phaser был использован для размещения отсутствующего нанотела с использованием модели гомологии полиаланина, основанной на записи PDB 4LAJ. Многочисленные итерации построения модели в Coot и уточнение TLS в Buster привели к получению окончательной модели с разрешением 4,2 Å (предпочтение Рамачандрана / выбросы: 93,34% / 0,83%) (дополнительная таблица 1 ).Для фигур использовали цепи A (TM287), B (TM288) и E (Nb_TM#2). Молекулярную графику и анализы выполняли в Pymol или с помощью UCSF Chimera 43 .

Анализы АТФазы

Активность АТФазы измеряли путем обнаружения высвобожденного фосфата с использованием метода молибдат/малахитовая зеленая. Для обнаружения фосфата реакционный раствор (90 мкл) смешивали с профильтрованным раствором для обнаружения малахитового зеленого (160 мкл), состоящим из 10,5 мг/мл молибдата аммония, 0,5 М H 2 SO 4 , 0.34 мг/мл малахитового зеленого и 0,1% Triton X-100, поглощение измеряли при 650 нм 8 . Измерения активности АТФазы с белком, очищенным детергентом, проводили в АТФазном буфере, состоящем из 20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ MgSO 4 , содержащего 0,03% (масса/объем) β-DDM. Измерения активности ТМ287/288, восстановленных в нанодисках, проводили в том же буфере без детергента. Измерения EfrEF, восстановленного в протеолипосомах, проводили в 50 мМ HEPES, pH 7.0 и 10 мМ MgSO 4 .

Относительная АТФазная активность TM287/288(D41A TM287 ), TM287/288(D65A TM288 ) и TM287/288(2xDtoA) по сравнению с TM287/288 дикого типа измерялась при 25 5°C в течение 25 5 мин. в присутствии 500 мкМ АТФ. Использовали 32 нМ TM287/288 дикого типа, 64 нМ одиночных вариантов DtoA TM287/288 и 128 нМ TM287/288 (2xDtoA) и соответствующую концентрацию TM287/288 (EtoQ) для вычитания фона.

Относительную АТФазную стимуляцию вариантов EfrEF в протеолипосомах этидием определяли при 30 °C в течение 15 мин в присутствии 1 мМ АТФ.Количество восстановленных вариантов EfrEF определяли с помощью количественного SDS-PAGE. Использовали 4 нМ EfrEF дикого типа, 23 нМ одиночных вариантов DtoA EfrEF и 15 нМ EfrEF (2xDtoA), а для вычитания фона брали контрольные буферы.

Ингибирование АТФазной активности TM287/288 и TM287/288 (2xDtoA) дикого типа в детергенте связующими определяли в присутствии 500 мкМ АТФ при 25 °C в течение 30 минут или 60 минут соответственно. Использовали 8 нМ TM287/288 дикого типа, а также TM287/288(2xDtoA), что более чем в 2 раза меньше самой низкой концентрации связующего (20 нМ).Для вычитания фона использовали равные количества TM287/288(EtoQ). Для получения значений IC 50 данные по ингибированию аппроксимировали гиперболической кривой затухания со следующей функцией (SigmaPlot): соответствует АТФазной активности при соответствующей концентрации связующего, деленной на АТФазную активность в отсутствие ингибитора, нормализованную к 100%, y 0 соответствует остаточной активности при бесконечной концентрации связующего, а соответствует максимальной степени ингибирования ( a  +  y 0  = 100%), а x соответствует концентрации связующего.

Стимулированную АТФазную активность TM287/288 и TM287/288 (2xDtoA) дикого типа в нанодисках определяли при 37 °C в течение 30 минут в присутствии 500 мкМ АТФ и различных концентрациях Hoechst 33342. 40 нМ TM287/288 дикого типа, а также TM287/288 (2xDtoA) использовали для определения относительной стимуляции по сравнению с базовой активностью АТФазы с использованием буфера для вычитания фона.

Ингибирование активности АТФазы, стимулированное Hoechst 33342, в нанодисках определяли при 37°С в течение 30 мин в присутствии 500 мкМ АТФ и 50 мкМ Hoechst 33342.8 нМ TM287/288 дикого типа и 40 нМ TM287/288 (2xDtoA) в нанодисках использовали для определения активности АТФазы в присутствии или отсутствии 10 мкМ связующих с использованием пустых нанодисков для вычитания фона.

Сшивание BMOE

Чтобы вырастить нанотела альпака, специфически распознающие OF-состояние TM287/288, транспортер был сшит в пучке тетраспирали, который формируется, когда транспортер принимает OF-состояние 13 . Два цистеина вводили в вариант TM287/288 без cys в положениях L200C , TM287 и S224C , TM288 посредством сайт-направленного мутагенеза.Кроме того, мутации 2xDtoA были введены в TM287/288_cl_L200C TM287 /S224C TM288 . Поскольку два цистеина находятся слишком далеко друг от друга, чтобы образовать дисульфидную связь, был использован малеимидный сшивающий агент BMOE (бисмалеимидоэтан, Thermo Scientific™, #22323) с длиной 8 Å. TM287/288_cl_L200C TM287 /S224C TM288 с мутациями 2xDtoA или без них экспрессировали, как описано выше. Мембраны солюбилизировали и очищали с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA в присутствии 1 мМ дитиотреитола (ДТТ) в 0.03% (мас./об.) β-ДДМ. Заменили буфер и удалили ДТТ с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в PBS, pH 7,4, и 0,03% (масса/объем) β-DDM при 4 °C и концентрировании до 50 мкМ. с концентратором Amicon Ultra-4 с MWCO 50 кДа. Добавляли 10 мМ АТФ, 3 мМ MgCl 2 и 5-кратный молярный избыток BMOE по отношению к переносчику, и сшивающую смесь инкубировали в течение 3 ч при 30°С. Смесь разводили в 5 раз и инкубировали с протеазой 3 C (1:10 вес/вес) в течение ночи при 4 °C.Перекрестно-сшитый транспортер, не содержащий меток, повторно загружали в колонку с гравитационным потоком Ni-NTA, уравновешенную 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 40 мМ имидазолом и 0,03% (масса/объем) β-DDM. Образец концентрировали с помощью концентратора Amicon Ultra-4 с MWCO 50 кДа, добавляли 10% (об./об.) глицерина, аликвоты подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте и хранили при –80 °C для подготовки к эксклюзионной хроматографии. . Сшитый TM287/288_cl_L200C TM287 /S224C TM288 с мутациями 2xDtoA или без них очищали эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Superdex 200 увеличения 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ Tris-HCl pH 7. .5, 150 мМ NaCl и 0,03% (мас./об.) β-DDM при 4°C и концентрировали до 1 мг/мл с помощью концентратора Amicon Ultra-4 с MWCO 50 кДа и немедленно использовали для иммунизации альпаки.

Отбор нанотел и тел

Для отбора нанотел, специфичных для состояния OF, альпаку иммунизировали подкожными инъекциями четыре раза с двухнедельными интервалами, каждый раз 200 мкг очищенного сшитого TM287/288(2xDtoA)_cl_L200C TM287 /S224C TM288 в 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 150 мМ NaCl и 0,03% (масса/объем) β-DDM. Иммунизация альпак была одобрена Кантональным ветеринарным управлением в Цюрихе, Швейцария (лицензия на эксперименты на животных № 188/2011). Кровь собирали через две недели после последней инъекции для получения РНК лимфоцитов, которую затем использовали для создания кДНК с помощью ОТ-ПЦР для амплификации репертуара VHH/нанотел. Были созданы библиотеки фагов и проведены два раунда фагового дисплея против TM287/288 (2xDtoA/EtoA), растворенных в β-DDM в присутствии 2  мМ ATP-Mg.После последнего раунда отбора фагового дисплея 91,9-кратное обогащение было определено с помощью количественной ПЦР с использованием AcrB в качестве фона. Обогащенную библиотеку нанотел субклонировали в pSb_init путем клонирования FX, и 94 отдельных клона анализировали с помощью ELISA в присутствии 1 мМ АТФ-Mg. 27 положительных результатов ELISA были секвенированы по Сэнгеру и сгруппированы в три семейства в соответствии с длиной и последовательностью их CDR3 (среди них был Nb_TM#1). В другом отборе сшитые TM287/288_cl_L200C TM287 /S224C TM288 использовали для иммунизации альпаки, что привело к 51 положительному результату ELISA, из которых 24 были секвенированы по Сэнгеру и сгруппированы в четыре семейства связывающих веществ (среди них был Nb_TM#2).

Сителла были отобраны против TM287/288 (E517A) в β-DDM в присутствии 1 мМ АТФ-Mg с помощью нашей платформы для селекции in vitro 14 . После второго раунда фагового дисплея отдельные клоны анализировали на связывание с TM287/288 (E517A) в присутствии ATP-Mg с помощью ELISA. Секвенирование 48 положительных результатов ELISA привело к получению 40 уникальных последовательностей sybody 14 .

Спиновое мечение для DEER

Варианты цистеина TM287/288 были экспрессированы, как описано выше, и очищены с помощью аффинной хроматографии Ni-NTA в присутствии 2  мМ DTT.Для спинового мечения DTT удаляли на колонке PD-10 (GE Healthcare, 17-0851-1), уравновешенной 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,03% β-DDM и MTSL [(1-оксил -2,2,5,5-тетраметил-Δ3-пирролин-3-метил)метантиосульфонат, Toronto Research] добавляли в 10-кратном молярном избытке и инкубировали при 4 °C в течение ночи. Свободная спиновая метка была удалена эксклюзионной хроматографией на колонке Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,03% (масса/объем) β-DDM. при 4 °С.Образцы концентрировали до концентрации 30–50 мкМ с помощью концентраторов Amicon Ultra-4 с MWCO 50 кДа, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80 °C в готовом виде для экспериментов с DEER. Пары 131 TM288 /248 TM288 / 248 TM288 и 460 TM287 /363 TM288 были уже использованы в предыдущих исследованиях 8 , 9 , в то время как внеклеточные пары спин-метки 54 TM287 /271 TM287 и 54 TM287 /290 TM288 были созданы в рамках этого исследования, и была определена их АТФазная активность (дополнительная таблица 3 ).

Для сайт-специфического спинового мечения Sb_TM#35 один цистеин был введен в каркас sybody в положении 71 посредством сайт-направленного мутагенеза. Sb_TM#35_S71C экспрессировали из pBXNPHM3, как описано выше. Клетки собирали и ресуспендировали в PBS с pH 7,4 и 2 мМ DTT с добавлением ДНКазы (Sigma) и разрушали с помощью M-110P Microfluidizer® (Microfluidics™). Супернатант, дополненный 20 мМ имидазолом, наносили на колонку с гравитационным потоком Ni-NTA, промывали 20 объемами колонки с PBS, pH 7.4, 50 мМ имидазола и 2 мМ DTT и элюировали 4 объемами колонки с PBS, pH 7,4, 300 мМ имидазолом и 2 мМ DTT.

На следующем этапе Sb_TM#35_S71C, слитый с His-меченым MBP, инкубировали с протеазой 3 C (1:10 вес/вес) при диализе против PBS pH 7,4 и 2 мМ DTT в течение ночи при комнатной температуре. Расщепленное sybody повторно загружали в гравитационную колонку Ni-NTA и элюировали тремя объемами колонки PBS pH 7,4, 40 мМ имидазолом и 2 мМ DTT с последующей эксклюзионной хроматографией с использованием колонки Sepax-SRT10C SEC-300 (Sepax Technologies), уравновешенной с PBS pH 7.4 и 2 мМ ДТТ. Собирали пиковые фракции и удаляли DTT с использованием колонки PD-10 (GE Healthcare, 17-0851-1), уравновешенной дегазированным PBS с pH 7,0, при 4°C. Чтобы избежать захвата DTT, сителла элюировали 3,2 мл дегазированного PBS с pH 7,0 вместо 3,5 мл, предложенных производителем. Элюат концентрировали до 2,5 мл с использованием концентратора Amicon с MWCO 3 кДа. К образцу добавляли 5-кратный молярный избыток MTSL и инкубировали в течение 1 часа на льду, что, как сообщалось ранее, предотвращает мечение скрытых цистеинов, образующих универсально консервативную дисульфидную связь нанотел 44 .Свободную метку удаляли и заменяли буфер с использованием колонки PD-10 (GE Healthcare, 17-0851-1), уравновешенной 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, и 150 мМ NaCl. Чтобы избежать захвата MTSL, сителла элюировали 3,2 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, и 150 мМ NaCl. Спин-меченые sybody концентрировали до желаемой концентрации с помощью концентратора Amicon Ultra-4 с MWCO 3  кДа, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре –80 °C. Специфическое для сайта мечение было подтверждено и количественно определено с помощью масс-спектрометрии.

Измерения DEER

Эффективность мечения двойных цистеиновых мутантов транспортеров, солюбилизированных в детергенте, измеряли путем сравнения второго интеграла спектров, зарегистрированных при 25 °C с использованием ЭПР-спектрометра X-диапазона Miniscope 400 (Magnettech by Freiberg Instruments) со стандартным водным раствором TEMPOL. Расчетная эффективность спинового мечения двенадцати мутантов колебалась от 80% до 90%. Для измерения DEER в качестве криопротектора добавляли 10% (об./об.) D 8 -глицерина.Диапазон конечных концентраций транспортера составлял от 15 до 25 мкМ. Образец (40 мкл) помещали в кварцевые пробирки с внешним диаметром 3 мм. Образец АТФ-ЭДТА содержал 2,5 мМ АТФ и 2,5 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) для полного ингибирования гидролиза АТФ; образцы инкубировали при 25 °C в течение 10 мин и быстро замораживали в жидком азоте. Для улавливания ванадата образцы инкубировали с 5 мМ ортованадата натрия, 2,5 мМ АТФ и 2,5 мМ MgCl 2 в течение 3 мин при 50   °C и мгновенно замораживали в жидком азоте.Немеченый Sb_TM#35 добавляли к TM287/288 в стехиометрическом соотношении ~1,3:1. Для измерения расстояний sybody-транспортер Sb_TM#35, меченный спином в положении 71, добавляли в стехиометрическом соотношении 0,5:1 к однократно меченым мутантам TM287/288 (54 TM287 и 271 TM287 ) в присутствии АТФ. — ЭДТА.

Измерения двойного электрон-электронного резонанса (DEER) проводились при 50 K на импульсном спектрометре Q-диапазона Bruker ELEXSYS E580Q-AWG (генератор сигналов произвольной формы), оборудованном усилителем TWT мощностью 150 Вт.Использовалась 4-импульсная последовательность DEER с гауссовским, неселективным наблюдателем и импульсами накачки длительностью 32 или 34 нс (соответствует 14 или 16 нс на полувысоте) с частотным разделением 100 МГц. Из-за когерентного характера импульсов, генерируемых генератором сигналов произвольной формы, для удаления эффекты бегущих эхо-сигналов от трассы DEER. Оценка данных DEER проводилась с помощью DeerAnalysis2015 45 .Фон первичных следов DEER корректировали с помощью растянутых экспоненциальных функций с однородными размерностями от 1,8 до 3 для разных выборок. Безмодельная регуляризация Тихонова использовалась для извлечения распределений расстояний из скорректированных по фону форм-факторов. Данные состояний апо и АТФ-ЭДТА, показанные для пар 131 TM288 /248 TM288 и 460 TM287 /363 TM288 в отсутствие sybody, воспроизводятся по сравнению с ранее опубликованными .Моделирование межспинового расстояния было выполнено с помощью программного обеспечения MMM2015 с использованием библиотеки температуры окружающей среды MTSL 46 , 47 .

Транспортный анализ

L. lactis NZ9000 ΔLMRAδLMRCD Клетки, укрывающие плазмиды дикого типа или мутантного EFREF, выращенные в среде M17, дополненные 0,5% глюкозы и 5 мкг / мл хлорамфеникола до 0,4. –0,6 при 30 °C, а экспрессию индуцировали добавлением низинсодержащего культурального супернатанта объемом л.lactis NZ9700 в течение 2 ч (1:1000 [об./об.]). Клетки промывали и ресуспендировали с использованием флуоресцентного буфера (50 мМ KP i , pH 7,0 и 5 мМ MgSO 4 ). Клетки разбавляли до OD 600 0,5 и активировали путем добавления 0,5% глюкозы. Накопление 5 мкМ этидия контролировали при 30 °C с помощью флуоресцентного спектрометра LS-55 (Perkin Elmer, Шверценбах, Швейцария). Длины волн возбуждения и излучения (и ширина щели) были установлены на 520 нм (10 нм) и 595 нм (15 нм) 16 , 17 .

Восстановление в протеолипосомы

E. coli полярные липиды, экстрагированные из E. coli общие липиды (Avanti lipids 100500 P) и L-α-фосфатидилхолин (из яичного желтка, тип ≥9% TL9-E, ≉9 ) P3556 Sigma) растворяли в хлороформе. Липиды смешивали в соотношении 3:1 (вес/вес), хлороформ выпаривали и высушенные липиды растворяли в буфере для восстановления (50 мМ K-HEPES, pH 7,0). Липиды обрабатывали ультразвуком для получения небольших однослойных везикул (SUV). Внедорожники были мгновенно заморожены в жидком азоте и оттаивались четыре раза, чтобы сплавить их в большие мультиламеллярные везикулы (LMV).Наконец, большие однослойные везикулы (LUV) были сформированы путем экструзии LMV через поликарбонатный фильтр 400 нм. LUV разбавляли до рабочей концентрации 4 мг/мл и дестабилизировали с использованием 5,25 мМ Triton X-100. Очищенные детергентом варианты EfrEF добавляли к дестабилизированным липосомам в соотношении белок:липид 1:100. Молекулы детергента удаляли четырьмя циклами добавления и удаления 200 мг биогранул (полистироловые гранулы SM-2, Bio-Rad). Протеолипосомы собирали центрифугированием (40 000 об/мин, ротор 70 Ti, Beckman) и ресуспендировали в 50 мМ K-HEPES pH 7.0 16 .

Поверхностный плазмонный резонанс

Сродство связывания определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 25 °C с использованием системы ProteOn™ XPR36 Protein Interaction Array System (Biorad). Биотинилированные варианты TM287/288 были иммобилизованы на сенсорных чипах ProteOn™ NLC с плотностью 2000 RU. Нанотела и синтела, экспрессированные в pSb_init, подвергали гель-фильтрации в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5, и 150 мМ NaCl, а измерения SPR проводили в том же буфере, содержащем 0.015% (w/v) β-DDM и либо 1 мМ MgCl 2 , либо 1 мМ MgCl 2 и 0,5 мМ АТФ для измерения аффинности связывания в отсутствие или в присутствии АТФ соответственно. Каждое измерение проводилось один раз, и данные соответствовали модели взаимодействия 1:1 с использованием программного обеспечения BioRad Proteon Analysis. Чтобы определить периоды полураспада различных вариантов TM287/288, связанных с АТФ, все пять биотинилированных вариантов были иммобилизованы на сенсорных чипах ProteOn™ NLC с плотностью 3000 RU.Эксперимент проводился в 20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,015% (вес/объем) β-DDM и 1 мМ MgCl 2 или 2,5 мМ ЭДТА при 25  °C при скорости потока 30 мкл/мин. Чтобы зарядить варианты транспортера АТФ-Mg или АТФ-ЭДТА, в начале эксперимента вводили буфер, содержащий 1 мМ АТФ вместе с 1 мМ MgCl 2 или 2,5 мМ ЭДТА.

Подготовка нанодисков

Мембранный каркасный белок MSP1E3D1 был субклонирован из pINITIAL (предоставлен Prof.Raimund Dutzler) в pBXNh4 (адген: плазмида № 47067) путем клонирования FX 36 . Свежетрансформированные клетки E. coli MC1061 выращивали в среде Terrific Broth (TB) с добавлением 100 мкг/мл ампициллина до OD 600 1,0–1,5 при 37 °C, а экспрессию индуцировали добавлением 0,0017% /v) L-арабиноза в течение ночи при 22 °C. Клетки собирали, ресуспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Na-фосфата, pH 7,4, 1% (об./об.) Triton X-100 и 1 мМ PMSF) и разрушали с помощью M-110P Microfluidizer® (Microfluidics™).Клеточный дебрис осаждали при 8000 г в течение 30 мин при 4°С, а супернатант загружали в гравитационную колонку Ni-NTA, уравновешенную буфером для лизиса, промывали 10 объемами колонки с буфером 1 (40 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,3 М). NaCl и 1% (об./об.) Triton X-100), 10 объемов колонки, буфер 2 (буфер 1 + 50 мМ холата натрия), 10 объемов колонки, буфер A (40 мМ трис-HCl, pH 8,0 и 0,3 M NaCl), 10 колоночные объемы буфера А, содержащие 20 мМ имидазола, и, наконец, элюировали 4 колоночными объемами буфера А, содержащего 300 мМ имидазола.Добавляли протеазу 3 C (1:10 масс./масс.) и образец подвергали диализу в течение ночи при 4 °C против 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 0,5 мМ K-ЭДТА. На следующий день к образцу добавляли 2 мМ MgCl 2 , который затем повторно загружали в гравитационную колонку Ni-NTA, уравновешенную 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl и 20 мМ имидазолом, и элюировали двумя тома столбцов с использованием одного и того же буфера. Буфер заменяли путем трехкратного диализа против Tris-HCl pH 7,5 и 0,5 мМ K-EDTA в течение 1,5 часов при комнатной температуре.Очищенный мембранный каркасный белок концентрировали до 60 мг/мл с использованием концентратора Amicon Ultra-4 с MWCO 10 кДа, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80°C.

Полярные липиды E. coli (экстракт полярных липидов E. coli , Avanti, 100600C) смешивали 3:1 (мас./мас.) с L-α-фосфатидилхолином из яичного желтка (Sigma, P3556) и хлороформом. испарился. Высушенные липиды растворяли в 20 мМ HEPES pH 8,0, 0,5 мМ K-ЭДТА, 100 мМ NaCl и 100 мМ холата до конечной концентрации 38 мг/мл (50 мМ) и фильтровали с использованием 0.Фильтр 22 мкМ. Липиды, готовые для воссоздания нанодисков, хранили при температуре -80 °C.

Очищенные, биотинилированные варианты TM287/288, солюбилизированные в β-DDM, были преобразованы в нанодиски с использованием молярного соотношения липидов 240:8:1:MSP1E3D1:TM287/288. Чтобы сэкономить мембранный белок, идеальное соотношение липидов: MSP1E3D1 было определено заранее путем восстановления пустых нанодисков. Были протестированы различные соотношения в диапазоне от 25:1 до 40:1 (липид:MSP1E3D1). Пустые нанодиски загружали в колонку Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare) для отделения пустых нанодисков от мономерного MSP1E3D1 и агрегатов.Из профиля элюции было определено оптимальное соотношение липид:MSP1E3D1 30:1. Конечная концентрация холата в смеси для восстановления была доведена до 30 мМ. Смесь инкубировали при 25°С в течение 20 мин при покачивании со скоростью 650 об/мин. Затем к 200 мкл восстанавливающей смеси добавляли 200 мг биогранул, которые инкубировали в течение ночи при 4 °C при покачивании со скоростью 1000 об/мин. Биошарики удаляли с помощью центробежных фильтров 0,1 мкм из ПВДФ. Полные нанодиски отделяли от пустых нанодисков с помощью гель-фильтрации с использованием Superdex 200 Увеличить 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенного 20 мМ Tris-HCl pH 7.5 и 150 мМ NaCl. Профиль SEC, а также анализ SDS-PAGE восстановленного нанодиска TM287/288 показан на дополнительном рисунке 2c . Варианты TM287/288, восстановленные в нанодисках, либо сразу использовали, либо мгновенно заморозили в жидком азоте и хранили при температуре -80 °C.

Моделирование МД

Настройка и параметры моделирования аналогичны нашей предыдущей работе 11 . Вкратце, с помощью GROMACS 48 было проведено МД-моделирование всех атомов TM287/288, встроенных в явно сольватированный бислой POPC.Следует отметить, что исходный организм TM287/288, гипертермофильная бактерия Thermotoga maritima , имеет уникальный липидный состав 49 , который трудно реализовать для моделирования МД. Для моделирования, инициированного со структурой IF (PDB: 4Q4A), ATP-Mg был присоединен к консенсусному сайту, а D41 TM287 и D65 TM288 были заменены аланинами. Мы провели 20 отдельных симуляций по 500 нс каждая (т.е. всего 10 мкс) при 375 К.Кроме того, было смоделировано состояние OF, начиная с кристаллической структуры (PDB: 6QUZ), показанной на рис., после удаления sybody и замены ATPγS на ATP. Кроме того, тот же набор симуляций был проведен для структуры OF, связанной с АТФ, в которой мутации 2xDtoA были введены in silico (всего еще 8 мкс). Кроме того, была смоделирована рентгеновская структура ОВ дикого типа в бислое POPE (вместо POPC) при 375 K (десять симуляций по 500 нс каждая, т.е. всего 5 мкс).

Искусственные рождественские елки с подсветкой | Передняя дверь

Встречайте праздничный сезон с очаровательной экспозицией, на которой представлены роскошные рождественские елки от Frontgate.Изучите нашу подборку реалистичных елок с предварительно освещенным дизайном и изящным флокированием, чтобы найти идеальную новогоднюю елку для дома.

Преимущества искусственных новогодних елок

Откройте для себя красивый стиль без беспорядка, которым вы сможете наслаждаться из года в год, с искусственными рождественскими елками от Frontgate! Наши искусственные рождественские елки можно легко собрать за считанные минуты, а в комплект поставки входит прочная подставка для елки, которую можно установить дома. Секционные конструкции позволяют взбивать деревья и придавать им форму по вашему вкусу, а усиленные кончики обеспечивают надежное место для подвески всех ваших любимых украшений.Стильные и удобные высококачественные новогодние елки упрощают праздничное украшение, и их не нужно поливать, чтобы поддерживать их роскошный вид.

Как выбрать идеальное искусственное дерево

Любимая и неподвластная времени идеальная елка станет сердцем вашего праздника. Выберите подходящие искусственные елки из нашего ассортимента впечатляюще реалистичных сортов сосен, елей и пихт, которые передают богатые зеленые оттенки и детали настоящих деревьев без потери.Воспользуйтесь нашим путеводителем по дереву, чтобы подобрать размер и стиль, подходящий для вашего помещения, и изучите наш широкий выбор предварительно освещенных и флокированных дизайнов, чтобы создать настроение зимней страны чудес.

Новогодние елки с подсветкой

Создайте очаровательную зимнюю сцену за считанные минуты с помощью предварительно освещенных искусственных рождественских елок разной высоты, каждая из которых украшена сотнями светящихся лампочек. Исследуйте реалистичные вечнозеленые конструкции, наполненные экологически чистым светодиодным освещением с теплыми белыми лампочками для уютной праздничной атмосферы.

Если вам хочется чего-то игривого, попробуйте искусственные деревья с разноцветными праздничными лампочками. Предварительно освещенные деревья с мигающими огнями добавляют еще больше блеска, позволяя легко создать рождественскую сцену, которая без особых усилий отражает ваш стиль.

И если вы хотите елку для своего крыльца, а также для вашей гостиной, ищите уличную рождественскую елку с предварительно освещенным светом, которая может выдержать воздействие элементов.

Искусственные рождественские елки из флока

Принесите в свой дом заснеженное сияние зимы с помощью искусственных новогодних елок из флока.Выберите один из классических вечнозеленых стилей с оттенком флокирования для тонкого снежного образа или создайте современный вид с дизайном с большим количеством флока.

Если вы ищете что-то новое и уникальное, обратите внимание на искусственные рождественские елки из флока уникальных оттенков, таких как металлик из розового золота. Глянцевые и элегантные, эти эффектные дизайны воплощают всю вечную красоту классической рождественской елки в ярком новом стиле, выделяющемся из толпы. Добавьте последний штрих к своему праздничному декору с помощью элегантных рождественских украшений самых разных дизайнов и цветов, которые дополнят любое дерево.

Создайте уютную атмосферу для всей семьи с помощью высококачественных новогодних елок от Frontgate. Просмотрите вечнозеленые, предварительно освещенные и флокированные дизайны, чтобы найти причудливые рождественские елки, которые передают тепло и традиции праздничного сезона.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.